张肄鹏, 张惠玲, 张　青, 黄　珍, 刘卫东, 周丽英

(深圳市龙华新区中心医院， 深圳 广东　518110)

一管法MLPA荧光探针溶解曲线分析技术检测15种高危型HPV方法的建立*

张肄鹏, 张惠玲, 张青, 黄珍, 刘卫东, 周丽英

(深圳市龙华新区中心医院， 深圳 广东518110)

[摘要]目的： 结合多重连接依赖探针扩增(MLPA)和荧光探针溶解曲线分析技术，建立一种一管法同时检测并分辨15种高危型HPV的方法。方法： 根据各HPV亚型的特异性序列设计MLPA探针，并在各亚型的MLPA探针中加入溶解温度(Tm)不同的人工核酸序列作为识别标志；使用特殊的耐高温连接酶和热启动Taq酶，通过温度控制使探针杂交、连接、PCR在一管反应中顺序进行；以各HPV亚型102拷贝至106拷贝的标准品质粒作为模版进行敏感度实验；将102～106拷贝的HPV亚型标准品进行两两混合作为模版，检测本方法对混合样本的检测能力；使用本方法和HPV分型试剂盒(导流杂交法)对临床样本进行平行检测，比较2种方法的差异。结果： 本方法可在一次反应内顺序完成MLPA探针杂交、连接、扩增3个步骤，扩增结果可通过不同荧光通道不同Tm值的溶解峰分辨不同的HPV亚型；本方法对标准品的检测灵敏度比经典的MLPA 3步法反应下降约一个数量级；本方法可同时检测至少2种HPV亚型的混合感染；对临床阳性标本的检出率与导流杂交法结果基本一致。结论： 本研究成功建立了一种利用一管法MLPA荧光探针溶解曲线技术检测15种高危型HPV的方法。

[关键词]乳头状瘤病毒，人； DNA探针，HPV； 溶解曲线分析； 多重连接依赖探针扩增