于德山，崔世恒，付士红，曹蕾，曹玉玺，陈生邦，李国太，蒋建祥，梁国栋

1. 甘肃省疾病预防控制中心，甘肃 730000； 2. 青岛大学，青岛 266071； 3. 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京 102206

*同为第一作者

2014年甘肃省部分地区蚊虫及蚊媒病毒调查

于德山1,*，崔世恒2,*，付士红3,*，曹蕾3，曹玉玺3，陈生邦1，李国太1，蒋建祥1，梁国栋3

1. 甘肃省疾病预防控制中心，甘肃 730000； 2. 青岛大学，青岛 266071； 3. 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京 102206

摘要：为调查甘肃省部分地区蚊虫及蚊媒病毒的种类及分布，本课题组2014年在甘肃省酒泉市和陇南市地区共采集蚊虫4 412只。酒泉市共采集蚊虫2属3种2 833只，其中背点伊蚊(Aedes dorsalis)2 665只(94.1%)、刺扰伊蚊(Aedes vexans)150只(5.3%)、淡色库蚊(Culex pipiens pallens)18只(0.6%)；陇南市共采集2属2种1 579只蚊虫，其中淡色库蚊1 451只(91.9%)、中华按蚊(Anopheles sinensis)128只(8.1%)。经实验室常规处理后，将蚊虫标本分为96批，接种于C6/36、BHK和Vero细胞，进行病毒分离和多种病毒基因特异性扩增检测。结果显示，96批蚊虫标本在3种细胞中均未出现细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，在18批蚊虫标本研磨液中检测到辽宁病毒(Liaoning virus，LNV)基因阳性。病毒核苷酸序列的遗传进化分析显示，在甘肃省检测到的辽宁病毒与此前在我国新疆维吾尔自治区发现的辽宁病毒亲缘关系最近。

关键词：甘肃省；酒泉市；陇南市；蚊虫；蚊媒病毒；辽宁病毒

虫媒病毒是指由吸血节肢动物传播的病毒，可引起发热、出血、脑炎、失明、孕畜流产等人兽共患病[1]。已证实虫媒病毒传播的媒介有586种[2]，其中300余种为蚊虫。蚊媒病毒分布广，在全球大多数地区有分布[3]，其中黄热病病毒曾是世界性公共卫生问题，给人类健康和经济带来了严重危害[4]。

自20世纪50年代以来，我国主要有4种虫媒病毒病存在和流行，即流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒(又称春夏季脑炎病毒)、新疆出血热病毒(又称克里米亚-刚果出血热病毒)、登革病毒[5]。近年来在我国发现了一些新的虫媒病毒及其感染疾病，如西尼罗病毒及其群体性病毒性脑炎的流行[6]、辛德毕斯病毒及其临床感染病例[7]。

甘肃省地处我国西北部，位于青藏高原、黄土高原和内蒙古高原的交界处。此前曾在甘肃省东南地区(天水市、陇南市)分离到乙型脑炎病毒、盖塔病毒和版纳病毒[8]，在甘肃省中部地区(白银市)分离到乙型脑炎病毒[9]，在甘肃省西北部河西走廊地区分离到辽宁病毒(Liaoning virus, LNV)[10]。陇南市位于甘肃省东南部，地处北亚热带，降水充足，适宜蚊虫滋生。自2006年以来，该地区未进行蚊虫及蚊媒病毒调查。而酒泉市位于甘肃省西北部地区，属于大陆性干旱气候，未进行过系统的虫媒病毒调查。鉴于此，本研究调查了近10年来陇南地区蚊虫及蚊媒病毒的种类与分布变化，还首次对酒泉地区蚊虫及蚊媒病毒的种类与分布进行了系统调查。

1材料与方法

1.1蚊虫标本的采集

用诱蚊诱卵器和功夫小帅牌诱蚊灯(武汉市吉星环保科技有限责任公司)进行蚊虫采集。采集时间为当日19∶00至次日凌晨7∶00左右，采集地点为动物圈、房舍旁等。将蚊虫标本在低温下进行形态学分类，每50只分为一管，编号登记，并放入液氮中保存，用干冰转移至实验室。

1.2蚊虫标本的实验室处理

将每批蚊虫标本转移至离心管中，加入1 mL组织培养液，封闭后放入TissueLyser振荡器(Qiagen公司)，震荡2.5 min，然后4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，小心吸除上清液，冰浴保存。

1.3组织培养细胞

金黄地鼠肾细胞(BHK-21细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和白纹伊蚊卵细胞(C6/36细胞)由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。其中C6/36细胞置于28 ℃孵育箱中培养，BHK和Vero细胞置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培养。

1.4病毒分离

取离心后的蚊虫研磨液各100 μL，分别接种于BHK-21、Vero和C6/36细胞，于37 ℃和28 ℃孵育箱中培养。每隔12 h在显微镜下观察细胞状态，观察是否出现细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。当细胞出现CPE并达细胞总量的75%时，收集细胞，-20 ℃反复冻融3次，将每批蚊虫上清液在3种细胞中盲传3代，无病变者视为病毒分离结果阴性。

1.5病毒核酸提取及cDNA文库制备

使用QIAamp®Viral RNA试剂盒(Qiagen公司)对蚊虫研磨液进行RNA提取，操作见试剂盒说明书。使用ready-to-go试剂盒(GE Healthcare公司)对每份蚊虫标本研磨上清液进行cDNA文库制备，标本冻存于低温冰箱。

1.6病毒基因的特异性检测

使用GOTaq®Green MIX PCR扩增试剂(Promega公司)，利用表1中的引物[11-14]，对蚊虫cDNA文库进行反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。对阳性结果进行DNA测序。

1.7测序结果分析

采用ClastalX 1.8软件对测序结果进行序列比对，MEGA 6.0软件制作基因系统发生树，MegAlign软件分析核酸与氨基酸的同源性[15]。

2结果

2.1蚊虫标本采集

2014年7月在甘肃省陇南市及酒泉市(图1)进行蚊虫采集工作。陇南市位于甘肃省东南地区(N33°40′，E104°92′)，海拔900～2 500 m；酒泉市位于甘肃省西北部(N39°44′，E98°31′)，海拔200～5 700 m。陇南市采集点选在房舍、动物圈旁，酒泉市采集点选在猪圈旁。两地共采集蚊虫4 412只，剔除雄蚊，并经形态学鉴定，陇南市共采集2属2种1 579只蚊虫，其中淡色库蚊1 451只(91.9%)、中华按蚊128只(8.1%)，表明淡色库蚊是当地优势蚊种；酒泉市共采集蚊虫2属3种2 833只，其中淡色库蚊18只(0.6%)、背点伊蚊2 665只(94.1%)、刺扰伊蚊150只(5.3%)，表明背点伊蚊是当地优势蚊种(表2)。

表1本研究所用引物

Tab.1Primers used in this study

引物名称扩增区段引物序列(5'-3')引用文献属特异性 引物黄病毒属布尼亚病毒属甲病毒属FU1CFD2BUPBDWM2WcM3WM2W2NS5(310bp)S(251bp)NSP1(434/310bp)TACCACATGATGGGAAAGAGAGAGAAGTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGCATGACTGAGTTGGAGTTTGATGTCGCTGTTCCTGTTGCCAGGAAAATYAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHWACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCC- DAYCCTGYCCNVTGMDNWSYVCNGARGAYCC[11][11][11]种特异性 引物GETE病毒辽宁病毒OYA病毒西藏环状病毒版纳病毒TYMONS3FNS3RLNV12s1LNV12r1OYA-11FOYA-2R6-4-2F6-4-2RBAV-12-854-SBAV-12-B2-RCuTLV-FCuTLV-RNS3(810bp)12S(435bp)NS(310bp)4S(848bp)12S(850bp)RDRP(400bp)CTTTCAGAGAGGACAGAGCGTCTCTTCTGCCGTTATCAAAGTTAGCACTGGCTCCGGCTGTAGTAACAGCTGTTCGGATCATCTGGAATTTGAGGTTAATAACCATTTTCCCCAACCTTCCTCATGAAGTTGACACGACAGACCAAAAGATATTCAACACGTAATCCAATAAAATTGATAGYGYTTGCGTAAGACGTTCTAAATTGGATACGGCGTGCTTTTCTGTGGCTATCTATTGGGCGTACAAGGAATCCGATGCTAGG[11][12][13][14][11]-

TYMO virus primer is self-designed and verified by RT-PCR.

图12014年甘肃省蚊虫采集分布图

Fig.1Mosquito collection sites in Gansu Province, 2014

表22014年甘肃省不同采集点蚊虫采集背景

Tab.2Background information of mosquito sample collection in Gansu Province, 2014

采集点蚊种中华按蚊数量(只)百分比淡色库蚊数量(只)百分比背点伊蚊数量(只)百分比刺扰伊蚊数量(只)百分比合计数量(只)百分比陇南市稻圭村00611.38%0000611.38%黄鹿坝村60.14%58313.21%000058913.35%马营村1222.76%80718.29%000092921.06%酒泉市拐坝村00180.41%106524.14%00108324.55%南坝村0000100022.67%00100022.67%瓜州000060013.60%1503.40%75016.99%合计1282.90%146933.30%266560.40%1503.40%4412100%

2.2病毒分离

将96批蚊虫标本研磨液分别接种至BHK、Vero和C6/36细胞，每批标本连续观察1周，与对照细胞相比，未见明显CPE。

2.3病毒基因检测

2.3.1病毒核酸检测以96批蚊虫研磨液制备的cDNA文库为基因扩增模板，用9种病毒(属)基因扩增引物进行PCR检测。结果显示，布尼亚病毒、黄病毒和甲病毒属引物扩增均为阴性，GETE病毒、OYA病毒、西藏环状病毒、版纳病毒、TYMO病毒特异性引物扩增也呈阴性，仅LNV特异性引物扩增呈阳性。18批蚊虫研磨液为LNV基因扩增阳性，相应标本在C6/36细胞培养上清液中也呈LNV阳性(表3)。其中陇南市采集的中华按蚊中4批LNV阳性，占4.2%(4/96)；淡色库蚊中11批LNV阳性，占11.5%(11/96)。酒泉市采集的淡色库蚊中1批LNV阳性，占1.0%(1/96)；背点伊蚊中2批LNV阳性，占2.1%(2/96)。

表32014年甘肃省蚊媒病毒基因检测

Tab.3Mosquito-borne arbovirus gene detection in Gansu Province, 2014

引物cDNA蚊虫研磨液中华按蚊陇南市淡色库蚊陇南市酒泉市背点伊蚊酒泉市刺扰伊蚊酒泉市C6/36细胞上清液中华按蚊陇南市淡色库蚊陇南市酒泉市背点伊蚊酒泉市刺扰伊蚊酒泉市辽宁病毒4/611/311/12/550/34/611/311/12/550/3版纳病毒0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3西藏环状病毒0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3GETE病毒0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3TYMO病毒0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3OYA病毒0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3布尼亚病毒属0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3黄病毒属0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3甲病毒属0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3

2.3.2病毒核酸序列进化分析对18批LNV基因检测阳性标本进行LNV第12片段基因的核酸序列扩增和测序，经BLAST对比证明所有病毒株均为LNV。登录GenBank查询其他地区LNV DNA序列(表4)，并与本研究对比(图2)。结果显示这些LNV病毒株分两型，其中1997年辽宁NE97-31为Ⅰ型，其他毒株为Ⅱ型。这18株阳性分离株处于同一进化分支，与辽宁NE97-12[16]、新疆HM745537-B9、新疆HM745559-J60[17]株的同源性最高，达95%以上。与新疆HM745538-B10[9]的同源性次之。

表4本研究所用辽宁病毒毒株的序列信息

Tab.4Sequence information of the Liaoning virus strains used in this study

基因地区病毒株GenBank号采集地点年份宿主第12片段新疆HM745559-J60HM745537-B9HM745538-B10HM745559HM745537HM745538猪圈2006库蚊辽宁NE97-12NE97-31AY701350AY317110猪圈1997背点伊蚊

图2新分离病毒第12片段基因系统发生树

Fig.2Phylogenetic trees of the 12th segment of Liaoning virus isolates

3讨论

本研究在酒泉市和陇南市开展蚊虫及蚊媒病毒调查工作，共采集蚊虫4 412只，其中中华按蚊占2.90%(128只)、淡色库蚊占33.30%(1 469只)、背点伊蚊占60.40%(2 665只)、刺扰伊蚊占3.40%(150只)。酒泉市背点伊蚊占酒泉市蚊虫总数的94.1%，陇南市淡色库蚊占陇南市蚊虫总数的91.9%，可见背点伊蚊和淡色库蚊分别是酒泉市和陇南市的优势蚊种。背点伊蚊为干旱草原的主要蚊种[18]，这与酒泉市干燥少雨的大陆性干旱气候条件相吻合；而陇南市部分地区属于亚热带气候，长期水分充足，适宜幼虫在污水中滋生的淡色库蚊大量繁殖，与2007—2008年的蚊虫调查结果一致，表明近几年当地蚊虫种群结构变化不大。在两地还分别发现了刺扰伊蚊和中华按蚊，表明当地蚊虫种群复杂多样，应加强灭蚊、防蚊技能及相关疾病的防治宣传，提高人们防蚊、灭蚊和预防疾病的意识。

本研究用RT-PCR共检出18株LNV阳性分离株，陇南市15株、酒泉市3株。其中陇南市淡色库蚊11株、中华按蚊4株；酒泉市背点伊蚊2株、淡色库蚊1株。这是继2014年在河西走廊地区发现LNV以来再次在甘肃省蚊虫中发现，且在甘肃省东南地区和西北地区同时检测到，充分表明加强甘肃省虫媒病毒检测及相关媒介调查相当必要。

研究显示我国LNV主要分布在高纬度地区，如新疆维吾尔自治区、青海省、山西省和辽宁省，且主要在库蚊和背点伊蚊中分离到[19]。本研究在甘肃省发现LNV，再次证明了LNV的高纬度分布特征；不仅从库蚊和背点伊蚊中分离到LNV，还首次从中华按蚊中分离到，为以后开展蚊虫调查提供了重要参考依据。

LNV属于新分离的12节段双链RNA病毒，在国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第8次报告中被归为Seadorna病毒属[20]。据文献报道，小鼠感染LNV后出现软弱无力，再次感染可导致出血、死亡[16]。虽还未有报道称LNV可致人兽患病及死亡，但其对人兽有潜在的威胁，因此对LNV的调查必不可少。

从基因进化方向来看，本研究中18株LNV位 于同一进化分支，与新疆HM745537-B9、HM745559-J60和 HM745538-B10株及辽宁NE97-12株的同源性达95%以上，可能为LNV进化方向及地域传播方向的研究提供重要依据。

综上所述，应深化陇南市和酒泉市两地蚊虫防治工作，加大蚊媒病毒的宣传，提高人们的认知程度及加强相关疾病的预防。

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Investigation of mosquitoes and mosquito-borne arboviruses in Gansu Province，China

YU Deshan1,*, CUI Shiheng2,*, FU Shihong3,*, CAO Lei3, CAO Yuxi3, CHEN Shengbang1, LI Guotai1, JIANG Jianxiang1, LIANG Guodong3

1. Gansu Provincial Center for Disease Control and Prevention, Gansu 730000, China; 2. Qingdao University, Qingdao 266071, China; 3. Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China

Abstract:The purpose of the current study is to investigate the distribution of mosquitoes and mosquito-borne arboviruses in Gansu Province. The mosquitoes were collected from Jiuquan and Longnan in 2014. 2 833 mosquitoes were collected from Jiuquan, including Aedes dorsalis 2 665 (94.1%), Aedes vexans 150 (5.3%) and Culex pipiens pallens 18 (0.6%). 1 579 mosquitoes were collected from Longnan, including Culex pipiens pallens 1 451 (91.9%) and Anopheles sinensis 128 (8.1%). All mosquitoes were divided into 96 pools and then inoculated onto C6/36, BHK and Vero cells for virus isolation and identification. The results showed that the 96 pools of mosquitoes inoculated on three cells revealed negative cytopathic effect (CPE). Eighteen pools of the mosquito samples showed positive for Liaoning virus (LNV) detection. The genetic evolution analysis of viral nucleotide sequences showed that Liaoning virus in Gansu Province had the closest relationship with the Liaoning virus isolated in Xinjiang Uygur Autonomous Region.

Key words:Gansu Province; Jiuquan; Longnan; Mosquito；Mosquito-borne arbovirus; Liaoning virus

基金项目：国家自然科学基金(81290342)

通信作者：梁国栋

Corresponding author. LIANG Guodong, E-mail: gdliang@hotmail.com

(收稿日期：2016-02-29)

·论著·