闫 宁,郭东锋,姚忠达,窦玉青,刘新民,张忠锋

(1.中国农业科学院 烟草研究所,山东 青岛 266101；2.安徽中烟有限责任公司 技术中心,安徽 合肥 230088)



烟草秸秆还田对土壤细菌多样性的影响

闫 宁1,郭东锋2*,姚忠达2,窦玉青1,刘新民1,张忠锋1

(1.中国农业科学院 烟草研究所,山东 青岛 266101；2.安徽中烟有限责任公司 技术中心,安徽 合肥 230088)

摘要：为了进一步验证烟草秸秆还田对土壤细菌多样性的影响,利用MiSeq平台对烟草秸秆未还田(no Tobacco Stalk Returning, nTSR)、1倍烟草秸秆还田(TSR1)和2倍烟草秸秆还田(TSR2)土壤的16S rDNA V3+V4区进行了测序分析。nTSR、TSR1和TSR2的Total Tags数目分别为41949、54761和60063,其OTUs(Operational Taxonomic Units)数目分别为1193、1275和1298。TSR1、TSR2丰度排名前35个属的物种丰度和丰度排名前10个属的OTUs丰度聚在一起,与nTSR有较为明显的区别。TSR1、TSR2的OTU (97%)、OTU (95%)、Chao1 (97%)、Chao1 (95%)、Shannon (97%)和Shannon (95%)指数均高于nTSR的。另外, nTSR与TSR1、TSR2之间的基于Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac距离的UPGMA聚类有明显差别。因此, TSR1、TSR2土壤细菌多样性高于nTSR的,而TSR1和TSR2土壤细菌多样性无明显差异。

关键词：烟草；秸秆还田；土壤细菌；多样性； 16S rDNA

烟草秸秆不仅含有大量的有机碳、纤维素和氨基酸,而且还含有丰富的P、K、Ca、Mg、B、Cu、Fe、Mn、Na和Zn等矿质元素[1]。秸秆还田能够把作物吸收的大部分营养元素归还到土壤中,避免因秸秆堆放、焚烧造成的环境污染等问题,是农业可持续发展的重要途径[2]。从长期效应来看,秸秆还田可明显改善土壤的理化性质,增加耕层土壤速效养分的有效性及全量养分的含量,提高土壤酶活性，改善土壤微生物状况及影响土壤腐殖质组分含量,从而提高土壤肥力[3]。在秸秆还田的初期秸秆还田可能会降低微生物利用碳源的能力,影响微生物群落物种分布的均匀度,致使作物对碳、氮的利用率下降[4]。土壤微生物以细菌的种类和数量最多,细菌在土壤营养元素循环、有机物质的形成和分解、土壤肥力的保持和提高、生态环境的改善、植物的生长发育和作物病虫害防治等方面均起着极其重要的作用[5-7]。模拟水稻秸秆原位还田条件的研究发现,秸秆还田能够增加土壤细菌群落分子多态性的丰富度[8-9]。

目前烟田土壤微生物研究的常规方法仍以微生物平板法为主,但该方法所用的培养基有一定针对性且其培养条件受限,而且可培养的土壤微生物只占微生物总量的0.1%～1.0%,因此常规分离培养方法难以全面评估土壤微生物群体的多样性[10]。16S rRNA位于原核细胞核糖体小亚基上,包括10个保守区域和9个高变区域,其中保守区在细菌间差异不大,而高变区具有属或种的特异性,随亲缘关系不同而有一定的差异[11-12]。因此,16S rDNA可以作为揭示生物物种的特征核酸序列,被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标[13-14]。16S rDNA扩增子测序,通常是选择某个或某几个变异区域,利用保守区设计通用引物进行PCR扩增,然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定,成为研究环境样品中微生物组成结构的重要手段[15]。

本文利用MiSeq平台对烟草秸秆未还田(no Tobacco Stalk Returning, nTSR)、1倍烟草秸秆还田(TSR1)和2倍烟草秸秆还田(TSR2)土壤的16S rDNA V3+V4区进行测序分析,通过进行Reads拼接过滤、OTUs聚类和物种注释及丰度分析,可以揭示烟田土壤细菌的构成；进一步的样品复杂度分析、多样品比较分析可以明确nTSR、TSR1和TSR2土壤之间细菌多样性的差异,从而进一步验证烟草秸秆还田对土壤细菌多样性的影响,为烟草秸秆还田提供理论和科学依据。

1材料和方法

1.1试验地点与试验设计

试验地点选择在安徽省宣城市宣州区黄渡乡的安徽中烟黄山焦甜香皖南科技示范园内,位于北纬30°47′、东经118°50′,海拔高度55 m。试验共设3个处理,即烟草秸秆不还田(nTSR)、1倍烟草秸秆还田(TSR1)和2倍烟草秸秆还田(TSR2),其中处理TSR1的烟草秸秆还田量为18000株/hm2,处理TSR2的烟草秸秆还田量为36000株/hm2。试验采用随机区组排列,3次重复,小区面积450 m2,每个小区9行,行距120 cm,株距50 cm。在烤烟采收后,灌水泡田,利用翻耕机将烟草秸秆直接打入田中,随即播种水稻。在水稻收获(11月20日)后,用取土器挖取5～20 cm深的土壤。将每个处理的3次重复土壤样品等量混合,用于细菌多样性分析。

1.2基因组DNA的提取和PCR产物扩增

采用CTAB法对样本的基因组DNA进行提取,之后采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度,取适量的样品于离心管中,使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板；根据所选择的测序区域,使用带Barcode的特异引物；使用New England Biolabs公司的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer。使用高效和高保真的酶进行PCR,确保扩增效率和准确性。引物对应区域：16S V3区引物为357F-517R,16S V4区引物为515F-806R。

1.3PCR产物的混样、纯化、文库构建和上机测序

对PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等浓度混样,在充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,使用Thermo Scientific公司的GeneJET胶回收试剂盒回收产物。使用New England Biolabs公司的NEB Next®UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库的构建,对构建好的文库进行Qubit定量和文库检测,在确认合格后,使用MiSeq进行上机测序。

1.4测序数据处理

在分析前,需要对下机数据进行预处理,具体处理步骤如下：(1)数据拆分：根据Barcode序列将下机数据拆分为不同样品数据,并截去Barcode序列和PCR扩增引物序列。(2)PE Reads拼接：将拆分的数据使用FLASH软件(V1.2.7)对每个样品的Reads进行拼接,得到的拼接序列为原始Tags数据(Raw Tags)[16]。(3)Tags过滤：对拼接得到的Raw Tags进行更严格的过滤处理[17],得到高质量的Tags数据(Clean Tags)。参照Qiime的Tags质量控制流程,进行如下操作：(a)Tags截取：将Raw Tags从连续低质量值(默认质量阈值为3)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；(b)Tags长度过滤：Tags经过截取后得到Tags数据集,进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags。(4)Tags去嵌合体序列：经过以上处理后，将得到的Tags序列与数据库(Gold database)进行比对(UCHIME Algorithm)[19]，检测嵌合体序列,并最终去除其中的嵌合体序列[20],得到最终的有效数据(Effective Tags)。

1.5信息分析流程

用Uparse 软件(v7.0.1001)[21]对所有样品的全部 Effective Tags序列进行聚类分析,默认提供以97%和95%的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs结果。在用Uparse构建OTUs时选取出现频数最高的序列,将这些序列集合用RDP Classifier (Version 2.2)[22]与GreenGene数据库[23]进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1.0)。为了进一步研究OTUs的系统发生关系以及不同样品之间优势菌群的结构组成差异,使用PyNAST软件(Version 1.2)[24]与GreenGene数据库中的“Core Set”数据信息[25]进行快速多序列比对,得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。随后的样品复杂度分析用于分析样品内的群落多样性,主要包含3个指标： OTU指数、Chao1指数和Shannon指数。同时,对16s rDNA可以利用PyNAST构建OTUs之间的系统发生关系,进一步计算Unifrac距离(Unweighted Unifrac)[26-27]。然后,利用OTUs的丰度信息对Unifrac距离进一步构建Weighted Unifrac距离[28]。为了研究不同样品间的相似性,通过对样品进行聚类分析构建样品聚类树。

1.6统计分析

用Excel整理试验结果,对所有数据在P<0.05水平下进行Tukey多重比较。试验中所有的分析在SPSS 18.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)统计分析软件中完成。

2结果与分析

2.1OUT分析结果

从图1中可以看出：处理nTSR、TSR1和TSR2的Total Tags数目分别为41949、54761和60063,其Taxon Tags数目分别为23809、30150和35872,其Unique Tags数目分别为18140、24611和24191,其OTUs数目分别为1193、1275和1298。由此可见,TSR2的Total Tags数目、Taxon Tags数目、Unique Tags数目和OTUs数目均最高, TSR1其次, nTSR最低。值得注意的是, nTSR、TSR1和TSR2的Unclassified Tags数目均为0,说明用于构建OTUs但没有获得分类信息的Tags数目为0。

从图2中可以看出： nTSR与TSR1共有及各自独有的OTUs分别为1108、85、127个； nTSR与TSR2共有及各自独有的OTUs分别为1136、57、125个； TSR1与TSR2共有及各自独有的OTUs分别为1172、63、89个；同时, nTSR、TSR1与TSR2共有的OTUs为1071个, nTSR独有的基因为20个, TSR1独有的基因为26个, TSR2独有的基因为24个。因此, nTSR、TSR1与TSR2共有的OTUs占绝大多数,而三者独有的OTUs只占少数。

2.2物种注释结果

从图3中可以看出： nTSR、TSR1和TSR2在界(Kingdom)水平上的序列数目分别为23809、30150和35872；其在门(Phylum)水平上的序列数目分别为23496、29832和35385；其在纲(Class)水平上的序列数目分别为23058、29479和34893；其在目(Order)水平上的序列数目分别为19105、23985和28845；其在科(Family)水平上的序列数目分别为12795、15879和18885；其在属(Genus)水平上的序列数目分别为5002、6994和7886；其在种(Species)水平上的序列数目分别为86、129和126。因此,注释到界、门、纲、目、科、属和种水平上的序列数目依次降低； TSR2注释到的序列数目最多, TSR1次之, nTSR最少。

根据物种注释结果,选取在门(Phylum)分类水平上最大相对丰度排名前10的门,生成的物种相对丰度分布柱形图见图4。从图4中可以看出,烟田土壤细菌相对丰度排名前10的门依次是变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、泉古菌门(Crenarchaeota)、绿菌门(Chlorobi)、NC 10菌门、WS3菌门。因此,烟田土壤细菌主要集中在这10个门中,其它门的细菌只占少数。

选取最大相对丰度排名前10的属所对应OTUs的系统发生关系数据,并结合每个OTUs的相对丰度及其代表序列的物种注释置信度信息,整合结果展示如图5,可以直观地展示研究环境中的物种组成的多样性。烟田土壤细菌相对丰度排名前10的属依次是CandidatusSolibacter、Anaeromyxobacter、CandidatusKoribacter、Geobacter、GOUTA19、Rhodoplanes、4-29、Nitrospira、LCP-6、Rhodococcus。从图5中可以看出：CandidatusSolibacter和CandidatusKoribacter两个属细菌的亲缘关系较近；其余8个属细菌的亲缘关系较近。

2.3物种丰度聚类结果

根据所有样品在属水平上的物种注释及丰度信息,选取丰度排名前35的属及其在每个样品中的丰度信息绘制热图,并从分类信息和样品间差异两个层面进行聚类,便于结果展示和信息发现,从而找出研究样品中聚集较多的物种或样品,结果展示见图6。TSR1、TSR2的丰度排名前35个属的物种丰度聚在一起,说明1倍和2倍烟草秸秆还田之间的土壤细菌群落的分子多态性差异不明显；TSR1、TSR2的丰度排名前35个属的物种丰度与nTSR有较为明显的区别,说明烟秆还田能够明显改变土壤细菌群落的分子多态性。

选取最大相对丰度排名前10的属所对应OTUs的系统发生关系数据,以及它们对应的OTUs的相对丰度信息,实现OTUs水平上的样品聚类(纵向聚类),以此考察不同样品间的相似或差异性,展示结果见图7。TSR1、TSR2的丰度排名前10个属的OTUs聚在一起,说明1倍和2倍烟草秸秆还田之间的土壤细菌群落的分子多态性差异不明显；TSR1、TSR2的丰度排名前10个属的OTUs丰度聚类与nTSR有明显的区别,说明烟秆还田能够明显改变土壤细菌群落的分子多态性。

2.4样品复杂度分析结果

对不同样品在不同一致性(Identity)阈值水平(默认提供97%、95%两个阈值)下的样品复杂度分析的指数进行统计,结果如表1所示。由表1中可见,TSR2的OTU (97%)、OTU (95%)、Chao1 (97%)、Chao1 (95%)、Shannon (97%)和Shannon (95%)最大,TSR1其次,nTSR最小。OUT指数值用来反映测序深度情况, Chao1指数值用来评估群落物种数, Shannon指数值用来反映群落多样性。烟草秸秆还田后Chao1、Shannon指数值均增加,表明烟秆还田后土壤细菌群落物种数和细菌群落多样性增加；而TSR1、TSR2的Chao1、Shannon指数差异较小,说明1倍和2倍烟草秸秆还田之间的土壤细菌群落物种数和细菌群落多样性差异并不明显。

注：括号内为不同一致性阈值。

2.5多样品比较分析结果

以Weighted Unifrac距离矩阵和Unweighted Unifrac距离矩阵做UPGMA聚类分析,并将聚类结果与各样品在门水平上的物种相对丰度整合展示,结果见图8,其中左图是UPGMA聚类树结构,右图是各样品在门水平上的物种相对丰度分布图。从图8中可见： TSR1和TSR2之间的基于Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac距离的UPGMA聚类可以聚在一起,说明1倍和2倍烟草秸秆还田之间的土壤细菌多样性差异较小； nTSR与TSR1、TSR2之间的基于Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac距离的UPGMA聚类有明显差别,说明烟草秸秆还田后土壤细菌多态性发生了明显的改变。

3讨论

限于目前的研究技术,土壤中只有很少种类的微生物是可人工培养的,因此采用常规分离培养的方法研究土壤微生物的多样性存在困难[29]。利用MiSeq平台对16S rDNA的一个或多个高变区测序,具有测序深度高、有利于鉴定低丰度群落物种以及费用低的特点,已成为研究微生物群落多样性的首选之策[30-31]。本研究对nTSR、TSR1和TSR2三个土壤样本的16S rDNA的V3+V4区进行MiSeq测序,研究了烟草秸秆还田对土壤细菌多样性的影响。结果表明：烟草秸秆还田(TSR1、TSR2)的丰度排名前35的属的物种丰度、丰度排名前10个属的OUT聚类与烟草秸秆未还田(nTSR)有明显区别(图6、图7)； TSR1、TSR2的Chao1、Shannon指数值大于nTSR的(表1),而且nTSR与TSR1、TSR2之间的基于Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac距离的UPGMA聚类有明显差别(图8),说明烟草秸秆还田导致土壤细菌多样性增加； TSR1、TSR2丰度排名前35的属的物种丰度、丰度排名前10个属的OUT聚在一起(图6、图7),且两者之间的Chao1、Shannon指数差异不明显(表1),说明1倍和2倍烟草秸秆还田之间的土壤细菌多样性差异并不明显。

本研究还发现：烟田土壤细菌相对丰度排名前10的门依次是变形菌门、酸杆菌门、硝化螺旋菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门、放线菌门、泉古菌门、绿菌门、NC 10菌门和WS3菌门(图4)；烟田土壤细菌相对丰度排名前10的属依次是CandidatusSolibacter、Anaeromyxobacter、CandidatusKoribacter、Geobacter、GOUTA19、Rhodoplanes、4-29、Nitrospira、LCP-6、Rhodococcus(图5)。本试验明确了烟田土壤中的细菌优势菌群,为今后烟田的土壤细菌多态性的分析奠定了基础。nTSR、TSR1和TSR2注释到属水平上的序列数目分别为5002、6994和7886,其注释到种水平上的序列数目分别为86、129和126,注释到种水平上的序列数目非常有限,目前的研究结果很难确定烟草秸秆还田后土壤中全部细菌物种群落多态性的变化(图3)。烟草细菌性病害主要包括青枯病、野火病、角斑病、剑叶病、空茎病、细菌性黑茎病、细菌性叶斑病和细菌性黑腐病等[32]。本试验并不能够确定烟草秸秆还田后土壤中细菌性病原菌的群落多态性的变化。当然,烟草秸秆还田后土壤细菌性病原菌群落变化应该与烟草植株上的细菌性病原菌数量有关,今后应该重点研究不同病情指数烟草秸秆还田对土壤细菌性病原菌群落多态性的影响。

4结论

TSR1、TSR2的丰度排名前35的属的物种丰度、丰度排名前10个属的OTU聚在一起,与nTSR有较为明显的区别； TSR1、TSR2的OTU (97%)、OTU (95%)、Chao1 (97%)、Chao1 (95%)、Shannon (97%)和Shannon (95%)高于nTSR的； nTSR与TSR1、TSR2之间的基于Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac距离的UPGMA聚类有明显差别。总之,烟草秸秆还田后,土壤细菌多样性增加,而1倍和2倍烟草秸秆还田的土壤细菌多样性差异不明显。

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(责任编辑：黄荣华)

Effects of Tobacco Stalk Returning on Soil Bacterial Diversity

YAN Ning1, GUO Dong-feng2*, YAO Zhong-da2, DOU Yu-qing1, LIU Xin-min1, ZHANG Zhong-feng1

(1. Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China;2. Technology Center of Anhui Cigarette Industrial Limited Company, Hefei 230088, China)

Abstract：Using the MiSeq system to further validate the effect of tobacco stalk returning on soil bacterial diversity and sequenced the V3 and V4 regions of 16S rDNA of soil bacteria obtained from the following soil sources: no tobacco stalk returning (nTSR), 1 × tobacco stalk returning (TSR1), and 2 × tobacco stalk returning (TSR2). The results showed that the total tag numbers of nTSR, TSR1, and TSR2 samples were 41949, 54761, and 60063, respectively, and the operational taxonomic units (OTUs) were 1193, 1275, and 1298, respectively. The overall species abundance of the 35 genera in TSR1 and TSR2 samples was significantly different from that of in nTSR, the overall OTUs of the top 10 genera from TSR1 and TSR2 samples were significantly different from that of in nTSR. The OTU (97%), OTU (95%), Chao1 (97%), Chao1 (95%), Shannon (97%), and Shannon (95%) index of TSR1 and TSR2 were higher than those of in nTSR. In addition, UPGMA cluster between nTSR and TSR1, TSR2 based on Weighted Unifrac distance and Unweighted Unifrac distance showed obvious difference. The higher diversity was observed in the soil bacteria from TSR1 and TSR2 than in nTSR, while no significant difference was observed between TSR1 and TSR2 in terms of soil bacterial diversity.

Key words：Tobacco; Straw returning; Soil bacteria; Diversity; 16S rDNA

收稿日期：2015-10-21

基金项目：中国烟草总公司科技重点项目“烤烟生产结构优化效应及关键技术研究与应用”(110201402007)；安徽中烟工业有限责任公司科技计划项目“皖南烟叶生产GAP管理模式研究”(2014124)、“皖南烟叶生产等级结构优化技术研究”(2014125)。

作者简介：闫宁(1987─),男,助理研究员,博士,主要从事烟草功能成分和综合利用研究。*通讯作者：郭东锋。

中图分类号：S154.381

文献标志码：A

文章编号：1001-8581(2016)05-0040-06