唐德智

南宁食品药品检验所，广西　南宁　530001



UPLC波长切换法测定玉叶清火片中3种成分的含量

唐德智

南宁食品药品检验所，广西南宁530001

【摘要】目的：建立UPLC波长切换法测定玉叶清火片中栀子苷、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量。方法：采用Agilent ZORBAX RRHD C18(2.1 mm×100mm, 1.8μm)色谱柱；流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)系统梯度洗脱，流速为0.2 ml/min，柱温：30℃，波长切换时间序列采样: 0～6 min 为238 nm，6～16min为225 nm，16～25 min为254 nm。结果：栀子苷进样量在0.026～0.232 μg范围内线性关系良好(r=0.9997，n=5)，平均回收率为99.95%，RSD为1.05%(n=9) ；穿心莲内酯进样量在0.025～0.222μg范围内线性关系良好(r=0. 999 8，n=5)，平均回收率为99.92%，RSD为1.19%(n=9)；脱水穿心莲内酯进样量在0.015～0.137 μg范围内线性关系良好 (r=0. 999 8，n=5)，平均回收率为99.12%，RSD为1.52%(n=9)。结论：该方法简便、快捷、准确，可用于该制剂的质量控制。

【关键词】玉叶清火片；栀子苷；穿心莲内酯；脱水穿心莲内酯；UPLC；波长切换法

玉叶清火片是由玉叶金花、穿心莲、栀子、墨旱莲、倒扣草等5味中药制成的中药制剂，为国家中成药标准汇编收载品种，具有清热解毒、消肿止痛的功效，临床用于喉痹，暴喑，急性咽喉炎以及其他风热症的治疗。方中穿心莲为臣药，具有清热解毒、凉血、消肿的功效，2010年版《中国药典》一部将穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯作为穿心莲药材的质量控制指标[1]；栀子为臣药，具有泻火除烦，清热利湿，凉血解毒的功效，2010年版《中国药典》一部将栀子苷作为栀子药材的质量控制指标[2]。玉叶清火片质量标准中含量测定项为用HPLC测定穿心莲中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量。制剂中另一主要药味栀子只有薄层鉴别项目，无含量测定方法[3]。HPLC分别测定栀子苷、穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯含量含量的方法已有报道[4-5]，但同时测定方法尚未见。实验参考相关文献道[6-8]，建立超高效液相色谱波长切换法同时测定玉叶清火片中栀子苷、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量的方法。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent 1290 Infinity 超高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；UV-2550型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；S180H型超声波清洗器(德国Elma公司)；XS205DU型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。1.2试药对照品栀子苷(批号：110749-201115)、穿心莲内酯(批号：110797-201108)、脱水穿心莲内酯(批号：110854-201308)均购自中国食品药品检定研究院；玉叶清火片(批号：20130326、20130513、20130718、20131007、20131028，广西纯正堂制药厂)。甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水。

2方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1混合对照品储备液精密称取栀子苷对照品19.43 mg、穿心莲内酯对照品18.71mg和脱水穿心莲内酯对照品11.41mg，置50ml棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得含有栀子苷0.3874mg/ml、穿心莲内酯0.3694mg/ml、脱水穿心莲内酯0.2276mg/ml的混合对照品储备溶液。

2.1.2供试品溶液取本品10片，除去包衣，研细，混匀，取约1.5g，精密称定，置50ml棕色量瓶中,加入甲醇约45ml，浸渍30min，超声处理(功率300W，频率33kHz)30min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液,用0.22μm的微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3阴型样品溶液按处方比例分别称取除穿心莲、栀子外其他药材适量，按玉叶清火片的制备工艺制得缺穿心莲的阴性样品及缺栀子的阴性样品，按照供试品溶液制备项下方法制备阴性样品溶液。

2.2色谱条件色谱柱: Agilent ZORBAX RRHD C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相:A为甲醇，B为0.1%的磷酸水溶液，0～5 min，27%A、5～8 min，27%～50%A、8～25 min，50%A；检测波长：0～6min为238 nm(栀子苷)、6～16min为225 nm(穿心莲内酯)、16～25min为254 nm(脱水穿心莲内酯)；流速为0.2 ml/min；柱温30℃；进样量：1μl。2.3检测波长的选择用紫外分光光度计分别对对照品溶液在200～400 nm波长范围内进行扫描，栀子苷在238 nm波长处有最大吸收，穿心莲内酯在225 nm波长有最大吸收，脱水穿心莲内酯在254 nm波长有最大吸收，与《中国药典》栀子 、穿心莲2味中药有效成分标注的检测波长一致，由此确定栀子苷的检测波长为238 nm，穿心莲内酯的检测波长为225 nm，脱水穿心莲内酯的检测波长为254 nm。

2.4专属性试验分别精密吸取供试品溶液、对照品混合溶液的稀释液、缺“穿心莲”和缺“栀子”的阴性样品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样。结果，在供试品溶液色谱图中，分别有与穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和栀子苷保留时间一致的特征峰，阴性样品无此特征峰，表明阴性样品对所测成分无干扰。色谱图见图1。

2.5线性关系考察精密吸取“2.2”项下混合对照品储备溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL置15 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成标准系列溶液。按照“2.2”项下色谱条件测定，分别进样1μl，测得峰面积的积分值。以对照品的进样量为横坐标 (x)，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。栀子苷回归方程及相关系数为Y=1.516×103x-13.25，r=0.9997(n=5)，进样量在0.026～0.232 μg范围内呈现良好线性；穿心莲内酯回归方程及相关系数为Y=1.989×103x-2.78，r=0.9998(n=5)，进样量在0.025～0.222 μg范围内呈现良好线性；脱水穿心莲内酯回归方程及相关系数为Y=1.337×103x-2.65，r=0.9998(n=5)，进样量在0.015～0.137 μg范围内呈现良好线性。

2.6精密度试验精密吸取“2.5”项下混合对照品溶液1μl，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下重复进样6次，以栀子苷、穿心莲内酯与脱水穿心莲的峰面积计算相对标准偏差(RSD )，分别为 0.9%、0.7%、1.2%，结果表明仪器的精密度符合要求。

2.7稳定性试验取同一供试品溶液 (批号：20130718)，分别在1、2、4、6、8、10、12 h内进样分析，进样量1μl，栀子苷、穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯峰面积的相对标准偏差(RSD )分别为 1.6%、1.7%、1.4%。结果表明供试品在12 h内稳定性良好，可满足检测时间的需要。

2.8重复性试验取同一批样品粉末(批号：20130718)1.5 g,精密称定6份，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液, 进样1μl，测得样品中栀子苷平均含量为4.37 mg/g，RSD为1.5%；穿心莲内酯平均含量为4.18 mg/g，RSD为1.2%；脱水穿心莲内酯平均含量为2.47 mg/g，RSD为1.3%。结果表明本法重复性好。

2.9加样回收率试验精取称取已测知含量的同一批号样品粉末(批号：20130718)9份，每份 0.75g，精密称定，置50 ml棕色量瓶中, 分别精密加入混合对照品溶液(栀子苷0.6628mg/ml、穿心莲内酯0.6272mg/ml、脱水穿心莲内酯0.3744mg/ml)4.0、5.0、6.0 ml，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样1μl测定，计算回收率。结果栀子苷、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的平均回收率(n=9)分别为99.95%、99.92%、99.12%，RSD分别为1.05%、1.19%、1.52%，表明本方法的准确度良好。

2.10样品测定取5批样品粉末，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.2”项下上述色谱条件进样进样1μl，用外标法计算样品中栀子苷、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量，见表1。

表1　样品测定结果　(n=5)

3讨论

3.1试验中对供试品溶液的处理方法进行了考察。采用甲醇索氏提取、加热回流及超声振荡提取，结果表明，超声振荡提取效果较好，故采用超声振荡法提取；再分别以乙醇、甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇作为提取溶剂，采用超声振荡法对供试品进行提取，并对超声振荡时间进行考察。结果表明，以甲醇超声提取30min效果最好。

3.2实验考察了甲醇-水、甲醇-磷酸溶液和乙腈-磷酸溶液系统的分离效果，并优化了流动相中磷酸的浓度，最终选择甲醇-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱，此系统下3中指标成分的分离效果及峰形较好，分离时间适中。

3.3为达到检测灵敏度高、干扰小的目的，利用Agilent 1290紫外检测器可变波长功能，建立HPLC波长切换法同时测定玉叶清火片中3个有效成分的含量，以保证各成分在最大吸收波长处检测，获得最佳检测效果。

3.4将超高效液相色谱用于玉叶清火胶囊中栀子苷、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量测定研究，与传统HPLC法相比较，能更快速、精确地完成玉叶清火片的质量分析。

参考文献

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:231-232.

[2]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:251-252.

[3]国家药品监督管理局.国家中成药标准汇编眼科耳鼻喉科皮肤科分册[S].2002.

[4]陈剑峰，林昊.HPLC法测定玉叶清火胶囊中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量[J].亚太传统医药，2009,5(3):23-24.

[5]初芳,刘琳,王禹.玉叶清火片中栀子苷的含量测定[J].医学信息，2013,26(1)：103-104.

[6]曾嵘,阎敏,刘建存.HPLC法测定复方红根草胶囊中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量[J].湖南中医学院学报,2006,26(4):25-28.

[7]林瑞群,姚五湖.HPLC法测定清肺抑火片中栀子苷的含量[J].中药新药与临床药理,2009，20(2):161-162.

[8]孟宪波.HPLC法测定莲栀清火胶囊中栀子苷、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(14):155-157.

作者简介：唐德智,副主任中药师, 主要从事中药制剂质量控制研究。 E-mai:tangdz7497@163.com

【中图分类号】R284.1

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2016)09-0026-02

(收稿日期：2016.03.03)