尹秀玲，白迎春，李子平，张立永，赵维姿

(河北北方学院动物科技学院，河北 张家口 075000)



改良三黄汤对感染耐药大肠杆菌鼠生化免疫影响

尹秀玲，白迎春，李子平，张立永，赵维姿

(河北北方学院动物科技学院，河北 张家口 075000)

摘要：目的探讨2副改良三黄汤(MTYSⅠ和MTYSⅡ)对多重耐药大肠杆菌人工感染小鼠生化指标及免疫力的影响。方法选取健康的小鼠80只，随机分为健康组、攻毒组、MTYSⅠ组、MTYSⅡ组。自感染试验菌第1 d起，试验组每只小鼠每天分别灌服1 mg·mL-1中药制剂提取物0.5 mL，连续7 d，第8 d采血测定生化指标及免疫器官指数。结果MTYSⅠ和MTYSⅡ中药方剂体外对1号菌株的MIC值分别为62.5 mg·mL-1、125 mg·mL-1；抑菌直径分别为30.9 mm、15.2 mm。只有MTYSⅠ组鼠的肝指数显著增加(P<0.05)，其它不明显。肝功能方面：谷丙转氨酶含量两治疗组极显著低于攻毒组(P<0.05)；碱性磷酸酶攻毒组在感染后下降较多，治疗组血清中ALP的含量均显著提高(P<0.05)；MTYSⅡ治疗组与阴性组差异极显著(P<0.01)。肾功能方面：尿素氮(BUN)、尿酸(UA)攻毒后呈显著(P<0.05)、极显著增高(P<0.01)，治疗后恢复。免疫方面：IgG含量MTYSⅠ治疗组显著降低(P<0.05)；IgA攻毒后极显著增加，MTYSⅠ治疗组极显著下降，MTYSⅡ治疗组显著下降(P<0.05)，但没有恢复正常；IgM攻毒组极显著增高，MTYSⅠ治疗组显著高于健康组(P<0.05)。其它方面，肌酸激酶含量各治疗组显著减少(P<0.05)，淀粉酶(AMY)治疗组显著提高(P<0.05)。结论改良三黄汤体外有较强的抑制耐药大肠杆菌作用，能促进机体免疫器官的发育，显著改变生化指标含量，具有保肝利胆作用。综上所述，MTYSⅠ方剂优于MTYSⅡ方剂。

关键词：改良三黄汤；耐药性大肠杆菌；生化指标；免疫器官指数

大肠杆菌对畜牧业生产和人类健康都有着严重的影响，临床有很多报道，由于研究新的抗菌药物周期很长，药物残留也带来治疗困难[1-3]。对抗耐药性大肠杆菌的中药复方抑制剂报道较少。中药可消除耐药性大肠杆菌的耐药性[4，5]。如果将分离鉴定的耐药性大肠杆菌感染鼠，利用自配中药抑制剂治疗，同时检测鼠的生化免疫力，可为该病今后防治提供一定依据。

1材料与方法

1.1材料

黄连、厚朴等均购自张家口医药公司，河北北方学院附属第一医院微生物科提供高度耐药的大肠杆菌1号(O142+O26+O13)。河北北方学院附属实验牧场提供昆明种小鼠。生化试剂盒、免疫球蛋白试剂盒采购自上海复星长征医学科学有限公司。ATCC25922本研究室保存，庆大霉素(含量63.8%)、阿莫西林(含量86.6%)等购自中国兽医药品监察所。

1.2方法

1.2.1抑制剂配方的制定及提取物的制备

根据传统三黄汤中药理论和配伍原则进行加减，制成如下配方：(1)改良三黄汤Ⅰ(modified Three Yellow SoupⅠ,MTYSⅠ)：黄柏、黄连、黄芩、芍药、赤芍、甘草。(2)改良三黄汤Ⅱ(MTYSⅡ)：黄连、黄芩、黄芪、黄柏、茯苓、金银花、穿心莲、苦参、木香、甘草。水煎浓缩为1 g·mL-1。

1.2.2最小抑菌浓度(MIC)和药物敏感性的测定

采用试管2倍稀释法对所制备的2副中药提取物需先测定其对1号耐药大肠杆菌株的MIC值。2副中药对上述菌株的抑菌圈直径采用打孔法测定，然后每孔加中药液100 μL，37 ℃培养20～24 h，观察结果。

1.2.3分组与模型制作

研究区出露地层为长城系星星峡岩群、下泥盆统阿尔彼什麦布拉克组、中泥盆统阿拉塔格组、下石炭统甘草湖组和第四系[9](图1b)。侵入岩主要为华力西中期晚石炭世花岗岩[10]。区内断裂构造极为发育，主要断裂阿其克库都克断裂、卡瓦布拉克断裂为NW—SE向，次级断裂多为NE—SW向分布。

取小鼠80只，随机分为4组：健康组、攻毒组、治疗MTYSⅠ组、治疗MTYSⅡ组，供给全价配合饲料，自由采食和饮水，每天观察小鼠的临床表现。据预试验的结果，后3组每只小鼠腹腔注射大肠杆菌液0.2 ml，约2.1×109CFU，健康组腹腔注射生理盐水0.2 ml。接种后8 h开始出现典型症状开始给药，治疗组以每日上午分别灌服1次0.5 ml MTYSⅠ、MTYSⅡ，连用7 d，第8 d逐只进行称重并剖检，测定肝脏、脾脏指数。摘取眼球采血分离血清做生化检测，总蛋白(TP)采用双缩脲法；IgA、IgG、IgM的含量采用免疫比浊法，以上实验在河北北方学院一附院检验科日立7150型全自动生化分析仪上测定。

表1　1号菌株的MIC结果

2结果

2.1组方中药对耐药性大肠杆菌的抑菌作用

MTYSⅠ和MTYSⅡ中药方剂体外对1号菌株的MIC值分别为62.5 mg·mL-、125 mg·mL-1；抑菌直径分别为30.9 mm、15.2 mm，MTYSⅠ无细菌生长。表1为前期实验测得的1号菌株的MIC结果，和ATCC25922株比较具有较高耐药性[6]。

2.2鼠免疫器官指数的测定结果

表2显示经1号株攻毒后，只有MTYSⅠ组鼠的肝指数显著增加(P<0.05)，其它不明显。

表2　二方剂对鼠免疫器官指数

注：上表中的数据两两进行比较，字母代表组别，与健康组比较，小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.3肝功能方面

中药提取物对耐药性大肠杆菌病引起的肝损伤起到保护作用，由表3可以看出。总胆固醇(CHO)：治疗后血清中CHO的含量，健康组和治疗组均比攻毒组高，但差异不显著(P>0.05)。总蛋白(TP)：攻毒治疗组低于攻毒组，但不显著。谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)：ALT在血清中的含量，攻毒治疗组极显著低于攻毒组(P<0.05)，AST差异不显著。碱性磷酸酶(ALP)：攻毒组在感染后下降较多，治疗组血清中ALP的含量均显著提高(P<0.05)。MTYSⅡ治疗组与阴性组差异极显著(P<0.01)。总蛋白(TP)：攻毒后与健康组比较有显著增高，治疗后恢复正常。

2.4肾脏功能

表3　MTYSⅠ、MTYSⅡ对鼠大肠杆菌感染后某些生化指标的影响

注：上表中的数据两两进行比较，字母代表与之比较的组别，小写字母表示差异显著(P<0.05)；大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.5免疫

IgG含量MTYSⅠ治疗组显著降低(P<0.05)。IgA攻毒后极显著增加，MTYSⅠ治疗组极显著下降，MTYSⅡ方剂组显著下降(P<0.05)，但没有恢复正常。IgM攻毒组极显著增高，MTYSⅠ方剂组显著高于健康组(P<0.05)。

2.6其它

肌酸激酶(CK)含量各组显著减少(P<0.05)，淀粉酶(AMY)治疗组显著提高(P<0.05)。

3讨论

3.1组方中药的抑菌作用

从MIC观察，1号菌有较高的耐药性，从药物敏感性的测定看，二方剂中草药对病菌和病毒均具有抑制和杀灭的作用。中药促进免疫器官和其它免疫细胞发生、分化、成熟、定居和增殖以及产生免疫应答。中药能够发挥其效力，主要是通过活性成分而实现的。黄芩素和黄芩苷具有抗菌抗病毒、清除氧自由基、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、解热、镇痛、保护心脑血管及神经元、保肝、预防或治疗糖尿病及其并发症等作用[5]。黄连对许多细菌、真菌以及病毒均有较好的拮抗作用，近几年随着老药新用的提出，黄连抗癌、降糖、调节免疫功能、改善心血管功能、降血压、抗血小板聚集等药效不断被发现[7]。

3.2促进机体免疫器官的发育，提高机体免疫力，保肝利胆，保肾排毒

黄柏、黄芪和茯苓、甘草酸等中的多糖有益成分能够提高肝、脾指数[7-9]，调节免疫、抗肿瘤、抗炎、保肝等多方面作用，茯苓多糖(50、25 μg·ml-1)体外可直接刺激小鼠脾细胞产生IgG和 IgM，茯苓有利于平衡血糖[10]。从结果看，MTYSⅠ肝指数、IgG和IgM增加。当肝脏出现病变损害严重时，碱磷酶从胆道排出受阻，同时合成减少使血清中ALP的含量迅速下降。血清型IgA可介导调理吞噬抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用，从3种免疫球蛋白结果观察，MTYSⅠ免疫力的影响较大。结果中CK含量各治疗储存减少以补充大量能量来抵抗病毒侵袭。AMY显著提高，甚至高出阴性对照组，说明调集大量的淀粉酶，以消化淀粉，供应能量。金银花中原酸降低肝脏甘油三酯含量，可减轻肝脏病理损伤程度[11]，大青叶具有利胆退黄，保肝护肝的作用[12]。防止肝细胞变性、坏死，促进肝细胞修复和再生，增强肝脏的解毒功能并有抑菌作用。穿心莲内酯对可卡因致肝脏毒性的保护作用，尿素氮在肾脏受损时，使血清中的尿素氮含量升高[13]。甘草和黄芪显著减少尿蛋白量，减轻肾脏病变促进肾损伤的修复，使血清中的尿素氮明显降低。

综合以上分析，MTYSⅠ中主要成分对鼠的生化指标方面影响较多，效果稍好。

4结论

改良三黄汤体外有较强的抑菌耐药大肠杆菌作用。

改良三黄汤能促进机体免疫器官的发育，显著改变生化、免疫指标含量，具有保肝利胆作用。

MTYSⅠ优于MTYSⅡ。

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[责任编辑：刘守义英文编辑：刘彦哲]

Biochemical and Immune Influences of Modified Three Yellow Soups on Mice Inoculated Drug-ResistantE.coli

YIN Xiu-ling,BAI Ying-chun,LI Zi-ping,ZHANG Li-yong,ZHAO Wei-zi

(School of Animal Science and Technology,Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the biochemical and immune influence of two doses of Modified Three Yellow Soups from patients(MTYS)on mice inoculated the multiple drug-resistant E.coli.Methods80 healthy mice were randomized into 4 groups(control group,poison group,MTYSⅠ group,and MTYSⅡgroup).The experiment groups were inoculated with the 0.5 ml extractive of 1 mg/mL MTYS for seven days. On 8thday,blood serum biochemical indicators and immune organ indexes were detected from some mice randomly taken from each group.ResultsMIC of MTYSⅠand MTYSⅡ were respectively 62.5 mg/mL and 125 mg/mL;Bacteriostatic diameter were respectively 30.9 mm and 15.2 mm.The liver index of MTYSⅠ increased significantly(P<0.05),other not obvious.About liver function:ALT contents of MTYSⅠand MTYSⅡgroups were significantly lower than that in poison group(P<0.05);ALP content of poison group was greatly decreased,but ALP in serum of treatment groups was significantly increased(P<0.05),ALP content of MTYSⅡ were extremely different from control group(P<0.01).About renal function:BUN and UA contents of poison group were significantly increased(P<0.05 and P<0.01,respectively),then recovered to normal value after treatment.About immunization:IgG content of MTYSⅠwas significantly reduced(P<0.05);IgA content of poison group was significantly increased(P<0.05),IgA contents of MTYSⅠ and MTYSⅡgroups were significantly reduced(P<0.05 and P<0.01,respectively),but not back to normal;IgM content of poison group was significantly increased(P<0.05),IgM content of MTYSⅠhigher than control group(P<0.05).CK contents of all groups were significantly lowered(P<0.05),and AMY content was significantly higher than treatment group(P<0.05).ConclusionMTYS could inhibit drug-resistant E.coli in vitro,promote development of immune organs,significantly change biochemical indicators content ,and protect liver and gallbladder.And MTYSⅠ could have better effect than MTYSⅡ.

Key words:modified Three Yellow Soups;the multiple drug-resistant E.coli;biochemical indicator;immune organ index

基金项目：河北省教育厅项目(Z2007214)

作者简介：尹秀玲(1968-)，女，河北张家口人，教授，硕士，研究方向为环境生理与药理毒理。

中图分类号：S 852.61+2

文献标识码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-1492.2016.03.004

来稿日期：2015-03-09