周奕洲 王淑雯 罗嘉伟 刘永达

金钱草提取液对大鼠肾TRPV5表达影响的实验研究

周奕洲 王淑雯 罗嘉伟 刘永达

目的 探讨金钱草提取液对草酸钙结石大鼠的成石抑制作用及可能的作用机制。方法 30只健康雄性大鼠按随机数字表法随机分为空白对照组（A组）、单纯结石组（B组）、金钱草干预组（C组），每组10只。A组给予生理盐水2mL/d；B组给予成石液（1%乙二醇饮水+1%氯化铵）2mL/d灌胃；C组给予成石液2mL/d+金钱草提取液2mL/d灌胃。各组大鼠在相同条件下共饲养56d后，光镜下观察各组大鼠肾组织切片中草酸钙结晶分布及组织病理改变；免疫组化，从蛋白水平分析TRPV5在各组大鼠中的表达情况。结果 A组和C组大鼠肾组织均不能观察到结石结晶，B组大鼠可发现多量的黑色钙盐结晶体沉积于肾小管腔内。A组、B组和C组TRPV5免疫组化阳性百分比分别为（47.40±14.04）%，（17.49±8.35）%和（28.41±10.12）%。与A组相比，B组大鼠的TRPV5表达量显著减少（P＜0.01）；与B组相比，C组大鼠肾组织的TRPV5蛋白表达水平明显提高（P＜0.01）。结论 金钱草提取液能够抑制大鼠肾脏组织草酸钙结晶的形成，其作用机制可能通过上调TRPV5表达量，从而减少了肾小管内钙盐结晶体的形成，具有保护肾脏的作用。

草酸钙结石；金钱草；TRPV5

尿路结石是世界各地共同存在的疾病，严重影响人类的健康。在中国，尿路结石是泌尿外科疾病最常见病种之一。近年来，由于人们对健康的重视以及医疗水平的发展，泌尿系结石的发病率明显增高。泌尿系结石大多是草酸钙结石，钙是结石成分中最主要的阳离子，含钙结石患者往往伴尿钙增多。有学者研究发现大约1/3的含钙结石患者发现尿钙增多[1]。尿钙离子增多时，无论是草酸钙还是碳酸钙，达到一定饱和度时即可形成结石，引起尿路梗阻[2]。最近研究揭示，钙离子转运通道V5（transient receptor potential cation channel V5，TRPV5）在人体肾脏集合管和远端小管上皮上高度表达，其存在对尿路钙离子重吸收方面潜在着重要的影响[3]。王少刚等[4]研究发现遗传性高钙尿结石大鼠TRPV5表达明显减少，大鼠尿路上的钙离子不能有效通过TRPV5重吸收，继而出现尿钙过饱和，草酸钙结石因此形成。

金钱草的正品是报春花科植物过路黄(lysimachia christinae hance）的新鲜或干燥全草。金钱草具有清热祛湿、利尿通淋的功效，以单味或组方配伍形式广泛应用于治疗尿路结石和胆道结石。金钱草经过不断研究，目前证实其不但能有效清除氧自由基，对组织起到抗氧化作用[5]，可降低尿钙的排泄[6]，以往的研究也提示金钱草具有降低尿钙含量的作用[7]，但具体机制尚不明确。鉴于此，通过该实验，提取金钱草滤液的1%乙二醇饮水+1%氯化铵的溶液对大鼠进行灌胃干预性给药8周，然后制作肾脏石蜡切片并观察肾组织草酸钙结晶及病理变化，检测TRPV5表达水平，拟探讨金钱草降低尿钙的可能机制。

1 材料与方法

1.1 一般材料 购于广州医科大学实验动物中心SD大鼠，均为雄性，体质量180～220g。

1.2 主要试剂和仪器 金钱草饮片，购于康美药业股份有限公司，产地广东；乙二醇(C2H6O2)，国药集团化学试剂有限公司生产；氯化铵(NH4Cl)，沪市生产；一抗（TRPV5）鼠抗人单克隆抗体(浓缩液)Envision免疫组化试剂盒(即用型)，购于Gene Tech(Shanghai)Company Limited；显微镜（日本尼康公司)；BMJ-Ⅲ型病理组织漂烘仪(中威医疗仪器有限公司)；TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机(中威医疗仪器有限公司)；徕卡-2015型切片机(德国徕卡公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 金钱草滤液的提取和制备 金钱草饮片15kg，先泡水约半小时，接着煎煮至沸腾后半小时，滤去药渣，滤液浓缩成浸膏3500mL，最终配成浓度为1.5g/mL的金钱草溶液。

1.3.2 成石液的制备 参考文献[8]制备草酸钙结石模型：将1%乙二醇与1%氯化铵，用蒸馏水配制而成的混合溶液。配制比例为：乙二醇1mL，氯化铵1g，用蒸馏水定容到100mL。

1.3.3 动物分组及模型制作 将动物适应性喂养7d后，采用完全随机抽样分为3组：空白对照组（A组），给予生理盐水2mL/d；单纯结石组（B组），给予草酸钙成石液2mL/d；金钱草干预组（C组），给予金钱草提取液2mL/d+成石液2mL/d。每组10只，以灌胃方式连续给药56d。

1.3.4 肾脏切片的制作及HE染色 喂养56d后，处死大鼠，切取左侧肾脏，然后将切取的标本固定于10%甲醛溶液中，维持1d后，用流动清水持续冲洗标本，接着将其置于80%的乙醇2h，之后置于90%的乙醇，2h后，再将标本置于95%乙醇，2h后再置于100%乙醇，2h后，将标本浸泡在二甲苯溶液中，2h后取出标本，浸泡于二甲苯和熔化的石蜡等比例混合溶液中，持续时间1h，接着取出标本浸泡于2个熔化的石蜡液里，3h后将熔化的石蜡液置于阴凉地方冷却，之后用石蜡切片机将凝固的石蜡块切成薄蜡带，数量5～8张，厚度5μm。最后在玻片涂上粘附剂，将蜡带固定在玻片上，于干燥箱里烘烤，温度45℃，时间1h。

1.3.5 免疫组化 将活体组织取材置于中性福尔马林固定，经全自动脱水机（固定、脱水、浸蜡），包埋，切片，至烤箱60℃～70℃30min，常规脱蜡至水，蒸馏水洗2遍，4%双氧水浸泡，8min后用EDTAph8.0高压锅修复抗原。具体步骤如下：煮沸后，放入病理切片，密封高压锅，等喷气后过2min，移至阴凉处冷却，取出切片加入抗体一（肥大细胞类胰蛋白酶），放入水浴箱约40min，温度调为37℃。取出切片，用PBS（ph7.3)持续冲洗12min，接着加入抗体二（Dako Envision K5007），置于室温环境，20min后用上述PBS再次持续冲洗切片，12min后用DAB（Dako Envision K5007）进行显色，用蒸馏水随时终止显色结果，在清水冲洗后用苏木素复染，2min后用95%酒精浸泡，取出烘干，最后用中性树胶封片。

1.3.6 取3组肾组织病理切片（包括免疫组织切片），在显微镜下在高倍视野下观察并拍照，将拍得的照片载入电脑，并用图像软件（Image-pro plus 6.0）测定各组所获照片的阳性区域面积。

1.4 统计学方法 本研究实验数据运用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料采用“x±s”表示，随机单位组设计资料用单因素方差分析（ANOVA检验），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 大鼠肾脏标本病理特点 肾标本病理切片在显微镜下可见A组中肾小球结构完整，未见硬化，肾小管未见萎缩，肾间质未见纤维化，集合管未见圆柱形蛋白聚体。与A组比较，B组和C组大鼠尽管肾小球结构清晰，但仍见有肿胀或萎缩、纤维化、部分肿大的近曲小管上皮细胞溶解，部分远曲小管管壁僵硬，管腔变小，间质偶见血管充血，提示造模后大鼠肾脏有不同程度的炎症损害。B组和C组镜下观察损伤的性质基本相同，但C组损伤的范围明显少于B组。见图1。

2.2 大鼠肾脏标本结晶特点 肾标本病理切片在显微镜下可见无论A组还是C组，肾标本切片均未见结晶沉积，B组大

2 结果

鼠可发现多量的黑色钙盐结晶体沉积于小管腔内，结晶性质不规则，团簇状存在，甚至堆积成大片。见图1。

图1 光镜示各组大鼠组织草酸钙结晶(箭头所示)情况(HE，×400)

2.3 大鼠肾脏TRPV5表达特点 TRPV5的表达情况可以运用免疫组化染色进行检测，如图2所见：棕黄色的阳性染色颗粒沉积于各组（包括A组、B组和C组）的肾小管上皮细胞膜上，而阳性染色在B组和C组显示的强度明显低于A组，而与B组相比，C组阳性染色强度较高。表1是TRPV5的免疫组化阳性百分比（%）结果显示：与A组相比，B组大鼠的TRPV5表达量显著减少（P＜0.01）；与B组相比，C组大鼠肾组织的TRPV5蛋白表达水平明显提高（P＜0.01）。从以上可以推测，金钱草可能潜在着上调肾组织中TRPV5表达量的作用，增加尿中钙离子的重吸收，继而降低尿钙浓度，最终减少了肾小管内钙盐结晶体的形成。

图2 各组大鼠肾组织TRPV5免疫组化图

表1 3组大鼠免疫组化检查结果（x±s）

3 讨论

血中钙离子通过肾小球滤过，继而经过肾小管的重吸收，最终决定了尿中钙离子的浓度。肾小管对钙吸收有的重两种方式：主动重吸收和被动重吸收。其中主动重吸收发生的部位在肾远端小管和集合管，是一种耗能的转运方式，在两种吸收方式对尿中钙离子总吸收量中，主动重吸收仅占的15%[9]，然而它是大部分钙离子调节因子的控制因素，能特异的调节尿中钙离子的浓度。有研究表明，肾小管上皮细胞膜是TRPV5蛋白表达的主要部位，而TRPV5是尿中钙离子主动重吸收的关键调控蛋白，当它大量表达时，可以有效地降低尿中钙离子的浓度[10]。Boros等[11]应用免疫组织化学方法证实了小鼠肾远曲小管及集合管的上皮细胞膜上有较高水平的TRPV5的表达，进一步对TRPV5基因敲除后发现，尿钙排泄量比正常对照组高出6倍，推测试TRPV5的本身缺陷所致。国内学者对草酸钙肾结石模型研究中也发现，与A组相比，成石组肾标本的TRPV5mRNA的表达水平明显降低，TRPV5作为肾脏中一种新型的钙离子通道，主要表达于肾小管，当TRPV5表达量减少时，降低对尿钙离子的重吸收量，当尿中钙离子达到一定饱和度时，草酸钙即能以晶体形式沉积下来[2]。

过去研究发现金钱草可以降低尿中钙离子的浓度[7]。研究中有一个缺陷是没成功收集到各组大鼠尿液，未能对各组大鼠尿钙进行分析。但是，病理结果发现，B组的肾脏钙盐沉积明显高于A组和C组。Finlayson[12]等研究发现，氯化铵作为一种酸化试剂，长期作用于肾小管可以引起肾毒性，促进草酸钙结晶的沉积。Water等[13]给大鼠饲喂氯化铵和乙二醇混合液，28d后将大鼠进行病理组织检查，发现大片草酸钙晶体分布于肾实质，同时观察到肾小球纤维样变、近端小管和远端小管萎缩。本实验发现B组和C组的肾组织病理切片均可观察到肾间质部分血管充血，部分肾小球肿胀或纤维化，肾小管上皮细胞肿大，管腔变细，偶见个别上皮细胞破裂。除此之外，B组尚可见较多结石结晶形成。而A组大鼠肾切片，肾小球结构清晰，未见明显肿胀、萎缩和纤维化，刷毛缘尚完整，未见结石结晶形成。这提示肾毒性药物氯化铵在造模中的重要作用，同时也提示乙二醇+氯化铵联用，造模成石效果确切。A组大鼠肾标本切片免疫组化后，发现肾小管表达较多的TRPV5蛋白。而B组的大鼠表达的TRPV5明显减弱，而相对B组，C组的TRPV5表达量上调，由此认为，金钱草提取液可能通过上调TRPV5的表达量，进而减少尿钙的排泄量，最终减少钙盐晶体在大鼠肾小管沉积。

综上所述，金钱草提取液在肾草酸钙结石模型大鼠中可明显抑制晶体形成，并有一定上调肾脏TRPV5的表达量。这种潜在的上调TRPV5表达作用可能是金钱草提取液防治泌尿系结石的作用机制之一。

[1] 杨嗣星，王玲珑，詹炳炎，等.镰刀状肾实质切开术治疗复杂性鹿角状肾结石[J].中华泌尿外科杂志，2003,24（2）：87-89.

[2] 桂志明，曾国华，吴文起，等.TRPV5在肾草酸钙结石模型大鼠肾组织中的表达及其意义[J].中华实验外科杂志，2009,26（11）：1572-1573.

[3] Lamber TT,Bindels RJ,Hoenderop JG.Coordinated control of renal Ca2+handling[J].Kidney int,2006，69(4)：650-654.

[4] 王少刚，胡东亮，席启林，等.新型钙离子通道TRPV5在遗传性高钙尿结石大鼠肾组织中的表达[J].中华泌尿外科杂志，2008,29（2）：124-126.

[5] Mi J,Duan J,Zhang J,et al.Evaluation of antiurolithic effect and the possible mechanisms of Desmodium styracifolium and Pyrrosiae petiolose in rats[J].Urol Res,2012,40(2)：151-161.

[6] Malini MM,Lenin M,Varalakshmi P.Protective effect of triterpenes on calcium oxalate crastal-induced peroxidative changes in experimental urolithiasis[J].Pharmacol Res,2000,41(4)：413-438.

[7] 邹志辉，催维奇.金钱草黄酮提取物对大鼠肾脏草酸钙结石形成的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013,19(4)：195-199.

[8] 蒋一强，李山，吴超伟，等.玉米须及芭蕉芯对小鼠肾草酸钙结晶抑制作用的形态定量研究[J].成都中医药大学学报，1999,22（3）：37-38.

[9] Costanzo LS,Windhager EE,Ellison DH,et al.Calcium and sodium transport by the distal convoluted tubule of the rat[J].J Am Soc Nephrol,1978, 235(5)：492-506.

[10] Egimez T,Tekin MI,Gonen M,et al.Efficacy and safety of a newgeneration shockwave lithotripsy machine in the treatment of single renal or ureteral stones：Experience with 2670 patients[J].J Endourol,2007,21(1)：23-27.

[11] Boros S,Bindels RJ,Hoenderop JG.Active Ca2+reabsorption in the connecting tubule[J].Pflugers Arch,2009,458(1)：99-109.

[12] Finlayson B,Reid F.The expectation of free and fixed particles in urinary stone disease[J].Invest Urol,1978，159(6)：442-448.

[13] De Water R,Noordermeer C,van der Kwast TH,et al.Calcium oxalate nephrolithiasis：effect of renal crystal deposition on the cellular composition of the renal interstitium[J].Am J Kidney Dis,1999,33(4)：761-771.

Objective To investigate the effect of aqueous extract from herba lysimachiae on calcium oxalate-induced kidney injury in vivo and fnd its possible mechanism. Methods The 30 healthy adult male rats were randomized into three groups: control group (group A), stone group (group B), herba lysimachiae group (group C). Group A was established with physiological saline by gavage (2mL per day), while Group B was established with 1% ammonium chloride and 1% ethylene glycol in drinking water by gavage (2mL per day), and group C were established with aqueous extract from herba lysimachiae (2mL per day) by gavage on the basis of group B (2mL per day). After feeding for 56 days, the rats from each group were sacrifced and we observed the location of crystallization of calcium oxalate in vivo kidney tissue and evaluated the pathological changes by microscopy. The location and protein content of TRPV5 expression in kidney tissue was detected by immunohistochemical staining. Results The kidney tissue of rats in both group A and group C were not observed crystallization of calcium, but the group B can be found a large amount of black crystals of calcium deposited in the renal tubules. The protein contents of TRPV5 in three groups were (47.40±14.04)%, (17.49±8.35)% and (28.41±10.12)% respectively. Compared with group A, the results of the protein content of TRPV5 were much lower than those in group B. Compared with group B (P＜0.01), the results of the protein content of TRPV5 were much higer than those in group C (P＜0.01). Conclusion The aqueous extract from herba lysimachiae seemed to prevent the formation of renal calcium oxalate crystallization in rats, which is probably due to the mechanism of upregulating the expression of TRPV5, thereby reducing the formation of crystallization of calcium in the renal tubules, and playing a role in protecting the kidneys.

Herba lysimachiae; Calcium oxalate; TRPV5

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.18.001

2011年广州市科技计划项目（2011J4100054）

广东 510120 广东省泌尿外科重点实验室 （周奕洲 王淑雯罗嘉伟 刘永达）

刘永达 E-mail：liuyongda.jinbi@163.com