陈悦　李书琴　黄兰　戴红卫重庆医科大学附属口腔医院正畸科·口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室·重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆 401147



骨形态发生蛋白2对成牙骨质细胞中硬化蛋白表达调控机理的研究

陈悦李书琴黄兰戴红卫
重庆医科大学附属口腔医院正畸科·口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室·重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆 401147

[摘要]目的探索成牙骨质细胞OCCM-30中骨形态发生蛋白2（BMP2）对硬化蛋白（SOST）表达的调控机制。方法用2种质量浓度的BMP2（50、100 ng·mL-1）处理成牙骨质OCCM-30细胞3、5、7 d，相同体积的PBS液为对照组，采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫印迹法检测SOST mRNA和蛋白的表达情况。将OCCM-30细胞分为5组：空白对照组、BMP2组、BMP2+dorsomorphin组、BMP2+SB202190组、BMP2+PD98059组，根据分组分别加入100 ng·mL-1的BMP2和相应的试剂共培养，于3、5 d时检测SOST mRNA和蛋白的表达情况。结果100 ng·mL-1BMP2对SOST表达的上调作用强于50 ng·mL-1BMP2，且有时间依赖性（P＜0.05）。BMP2+dorsomorphin组、BMP2+ SB202190组、BMP2+ PD98059组的SOST mRNA水平和蛋白质水平均降低，其中BMP2+dorsomorphin组降低最明显（P＜0.05）。结论成牙骨质细胞中BMP2主要是通过Smad信号通路介导上调SOST的表达。

[关键词]成牙骨质细胞；骨形态发生蛋白2；硬化蛋白；Smad信号通路；牙根修复

Correspondence: Huang Lan, E-mail: lanhuang29@126.com.

牙骨质是覆盖在牙根表面的矿化组织，较牙槽骨有较强的抗吸收能力，这是临床正畸治疗的重要基础，然而在正畸治疗时却常常发现有牙根的吸收。成牙骨质细胞是牙周膜中重要的功能细胞之一，能抵抗破牙骨质细胞的附着，更重要的是能够分泌形成新生的成牙骨质样组织，对已吸收的牙根表面进行修复。骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）可诱导牙周组织中前体细胞分化为成骨细胞和成牙骨质细胞；在分化成熟的成牙骨质细胞中，BMP2也表现出显著的调控矿化相关基因表达的作用，同时抑制细胞的体外矿化[1-2]。硬化蛋白（sclerostin，SOST）是一种骨形成负向调节的蛋白，能竞争BMP受体Ⅰ/Ⅱ与BMP的结合部位，从而减少BMP信号进而抑制成骨细胞的矿化[3]。在成牙骨质细胞中，SOST可抑制其增殖分化[4]。然而，在成骨细胞中BMP的Ⅰ型受体信号缺失可下调SOST的表达，提示BMP2信号可正向调控SOST[5]。由此可见，BMP2和SOST之间的调控机制认识尚未完善。本课题以成牙骨质细胞为研究对象，通过增强BMP2信号研究其对SOST表达的影响，并初步探索哪些BMP相关通路参与了BMP2的这种调控作用。

1　材料和方法

1.1主要材料和设备

成牙骨质细胞株OCCM-30（四川大学华西口腔医院白丁教授惠赠）。人重组 BMP2蛋白（Sigma公司，美国），Smad信号通路抑制剂dorsomorphin、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2通路抑制剂PD98059、p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路抑制剂SB202190（Selleck公司，美国），实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTPCR）试剂盒（TaKaRa公司，日本），倒置相差显微镜及照相系统（尼康公司，日本），FTC2000型RT-PCR基因扩增仪、FTC2000型聚合酶链反应合成仪（上海枫岭生物技术有限公司），ChemiDox XRS型凝胶成像及图像分析系统（Bio-Rad公司，美国）。目的基因SOST以及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehydephosphate dehydrogenase，GAPDH）的引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，其序列见表1。

表1　引物序列Tab 1　Primer sequences

1.2OCCM-30的培养

细胞培养液的组分为89%DMEM、10%新生小牛血清、1%的青霉素+链霉素。细胞生长至80%时在无菌条件下进行传代。用预热的PBS清洗3次，然后滴加0.5 mL胰酶消化细胞，显微镜下见细胞变圆，并开始脱落时用细胞培养液中和。离心（1 000 r·min-1，5 min）后去上清液，加入新鲜培养基，吹散细胞制成悬液，按1︰3传代，置于CO2孵箱，每2 d换液。

1.3不同浓度BMP2处理OCCM-30细胞后SOSTmRNA

和蛋白的表达

将同一批传代的对数期OCCM-30细胞铺六孔板，密度为每孔1×105个。铺板完成后将6孔板置于CO2孵箱内继续培养6 h，待细胞贴壁后，吸干培养液，每孔加入2 mL无血清培养基对细胞进行血清饥饿，于CO2孵箱内继续培养24 h。然后将实验分为3个组，实验1组和实验2组分别加入50 ng·mL-1和100 ng·mL-1的BMP2作用3、5、7 d，对照组加入相同体积的PBS液作用3、5、7 d，每 2 d换液。采用RT-PCR检测3组各时间点的SOST mRNA表达，免疫印迹法（Western blot）检测SOST蛋白表达。实验重复3次。

1.4BMP2相关通路对SOST表达的影响

OCCM-30细胞按密度为2×105个·mL-1接种于6孔板中，待细胞达到70%～80%融合时按照分组加入相应试剂。实验分为5组：空白对照组（A组）、BMP2组（B组）、BMP2+dorsomorphin组（C组）、BMP2+ SB202190组（D组）、BMP2+PD98059组（E组），后4组分别加入无血清培养基、2 μmol·mL-1dorsomorphin、10 μmol·mL-1SB202190、10 μmol·mL-1PD98059预作用6 h后，在培养液中加入终浓度为100 ng·mL-1的BMP2继续培养，并于第3天、第5天收集细胞进行检测。采用RT-PCR检测实验组和对照组各时间点的SOST mRNA的表达量，免疫印迹法检测SOST蛋白的表达量。实验重复3次。

1.5统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行方差分析，LSD检验进行组间多重比较，检验水准为双侧α=0.05。

2　结果

2.1不同浓度BMP2处理后SOST mRNA和蛋白的表

达

各组的SOST mRNA和蛋白表达水平见图1、2。在同一时间点，与对照组相比，实验1组和实验2组的SOST mRNA及蛋白表达水平均升高（P＜0.05），且实验2组对SOST表达的上调作用强于实验1组（P＜0.05），表现出浓度依赖性。无论是对照组还是实验组，随着培养时间的增加，SOST mRNA及蛋白的表达水平均呈现逐渐升高趋势（P＜0.05），表现出时间依赖性。

2.2药物处理3 d后各组SOST mRNA和蛋白的表达

药物处理3 d后各组SOST mRNA和蛋白表达水平见图3和4。RT-PCR结果显示：与B组相比，C组SOST mRNA表达水平明显降低（P＜0.05），而D、E组SOST mRNA表达水平无明显变化。免疫印迹法检测结果显示，与B组相比，C、D、E组SOST蛋白表达水平均降低，但C组降低最明显（P＜0.05）。

图1　各组SOST mRNA 水平Fig 1　The level of SOST mRNA of each group

图2　各组SOST蛋白表达水平Fig 2　Relative expression of SOST protein of each group

图3　处理3 d后各组SOST mRNA的表达Fig 3　The level of SOST mRNA of each group treated for three days

图4　处理3 d后各组SOST蛋白的表达Fig　4 Relative expression of SOST protein of each group treated for three days

2.3药物处理5 d后各组SOST mRNA和蛋白的表达

药物处理5 d后各组SOST mRNA和蛋白表达水平见图5和6。与B组相比，C、D、E组的SOST mRNA和蛋白质水平均降低，其中C组降低最明显（P＜0.05）；与A组相比，D、E组SOST蛋白表达水平无明显变化，而C组降低（P＜0.05）。处理5 d与3 d相比，除C组SOST mRNA和蛋白水平显示出减弱的趋势外，其余4组均表现出增强的趋势（P＜0.05）。

图5　处理5 d后各组SOST mRNA的表达Fig 5　The level of SOST mRNA of each group treated for five days

图6　处理5 d后各组SOST蛋白的表达Fig 6　Relative expression of SOST protein of each group treated for　five days

3　讨论

SOST是一种在成骨微环境中起重要作用的分泌型蛋白，与骨形成以及骨吸收过程中多种信号通路中的转录因子均有交互作用[6]。BMP/Smad信号通路在骨代谢过程中发挥着重要作用，与间充质干细胞的迁移、增殖、分化关系密切，除了正向调控骨形成之外，在某些特定条件下BMP2通过上调Wnt信号通路抑制剂DKK1、SOST等的表达水平而负性调控骨形成[7]。

Dudley等[8]在对人类成骨细胞的一项研究中发现，高表达的BMP2可以增加SOST基因启动子近端去甲基化，使得SOST基因转录活性得到提高，SOST mRNA水平升高，从而抑制骨形成。本研究通过使用50 ng·mL-1以及100 ng·mL-1的BMP2作用于成牙骨质细胞，分别于3、5 d后与对照组进行比较，发现在成牙骨质细胞中外源性的BMP2对SOST的表达也是具有促进作用的，并且100 ng·mL-1组的促进作用强于50 ng·mL-1组且有时间依赖性，与成骨细胞中的研究结果相符。Kim等[9]使用2 000、200、100、50 ng·mL-1的BMP2培养人骨膜细胞发现，高浓度的BMP2（2 000 ng·mL-1）通过DKK1与SOST抑制该细胞增殖且促进该细胞凋亡，低浓度BMP2对于骨膜细胞的增殖与凋亡却并未出现这种情况。本实验中BMP2的浓度分别为50、100 ng·mL-1，均为较低浓度的BMP2，结果表明在本实验涉及的浓度范围内，BMP2确实上调了SOST表达，也为本课题组后续研究BMP2上调SOST表达的可能机制筛选出了一个可靠的BMP2使用浓度，而更多浓度梯度的BMP2对于SOST基因的表达调控仍需要更深入的研究。

Delgado-Calle等[10]对BMP2上调SOST表达的机制进行了深入研究，利用甲基化抑制剂AzadC上调BMP2后再分别阻断了成骨细胞中的Smad信号通路、p38MAPK通路、MEK1/2信号通路及JNK信号通路，发现阻断Smad信号通路及阻断p38MAPK通路后SOST的表达明显降低，而其余组无明显变化，因此他们认为BMP2对于SOST基因表达的调控是经由BMP/ Smad信号通路和P38MAPK通路共同介导的。

本研究首先用100 ng·mL-1的BMP2增强SOST表达，然后加入Smad信号通路抑制剂dorsomorphin、p38 MAPK通路抑制剂SB202190、ERK1/2通路抑制剂PD98059，观察这种由BMP2带来的增强效应减弱的情况，分析其对应通路的调节作用。结果表明，处理3 d后BMP2+dorsomorphin组SOST mRNA水平明显低于BMP2组，BMP2+dorsomorphin组、BMP2+ SB202190组、BMP2+PD98059组SOST蛋白水平低于BMP2组，BMP2+dorsomorphin组降低最明显；处理5 d后，BMP2+dorsomorphin组、BMP2+SB202190组、BMP2+PD98059组的SOST mRNA水平和蛋白质水平均低于BMP2组，其中BMP2+dorsomorphin组降低最明显，且BMP2+dorsomorphin组低于空白对照组，而BMP2+PD98059组和BMP2+SB202190组的SOST蛋白水平与对照组持平。这与BMP/Smad信号通路阻断剂dorsomorphin关系密切。Yu等[11]详细研究了dorsomorphin及其作用机制，在其抑制Smad依赖型的BMP信号的同时，抑制BMPⅠ型受体的功能，还能抑制成骨细胞的分化。由此推测，dorsomorphin可能同样抑制了OCCM-30中一些结构相关BMP或者其他蛋白，使得BMP2+dorsomorphin共同作用的SOST水平远低于空白对照组。

综上所述，在成牙骨质细胞中BMP2正向调控SOST表达，且由BMP/Smad、P38MAPK 、ERK1/2信号通路共同介导，其中BMP/Smad信号通路可能在其中起主导作用。正畸过程中机械力的刺激是否促进了BMP2介导的SOST的表达，从而抑制成牙骨质细胞的修复功能，还需进一步的研究。

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[10]Delgado-Calle J, Arozamena J, Pérez-López J, et al.Role of BMPs in the regulation of sclerostin as revealed by an epigenetic modifier of human bone cells[J].Mol Cell Endocrinol, 2013, 369(1/2):27-34.

[11]Yu PB, Hong CC, Sachidanandan C, et al.Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism[J].Nat Chem Biol, 2008, 4(1):33-41.

（本文编辑 李彩）

Preliminary research on the expression of sclerostin mediated by bone morphogenetic protein 2 in cementoblast

Chen Yue, Li Shuqin, Huang Lan, Dai Hongwei.(Dept.of Orthodontics, The Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory for Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education, Chongqing 401147, China)

[Key words]cementoblast;bone morphogenetic protein 2;sclerostin;Smad signal pathway;root repair

[Abstract]Objective This research explores the regulatory role of bone morphogenetic protein 2 (BMP2) in the expression of sclerostin in OCCM-30 cementoblast.MethodsOCCM-30 cementoblasts were treated with 50 and 100 ng·mL−1BMP2 for 3, 5, and 7 days.SOST mRNA was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR).Western blot analysis was employed to detect the sclerostin levels in the nucleus.Five groups were prepared for the experiments: control, BMP2, BMP2+dorsomorphin, BMP2+SB202190, and BMP2+PD98059.OCCM-30 was pretreated with BMP2 for 3 and 5 days, and then the sclerostin and SOST mRNA levels were measured.ResultsRT-PCR and Western blot analyses showed that BMP2 upregulated the expression of SOST in a concentration-dependent manner.SOST expression increased with time (P＜0.05).Moreover, sclerostin levels of BMP2+dorsomorphin, BMP2+SB202190, and BMP2+PD98059 groups were lower than that of the BMP2 group, and the sclerostin level in BMP2+dorsomorphin group was lowest (P＜0.05).ConclusionThe upregulation of SOST by BMP2 in OCCM-30 is mainly mediated by the BMP2/Smad signal pathway.

[中图分类号]R 780.2

[文献标志码]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.006

[收稿日期]2015-11-16； [修回日期]2016-01-18

[作者简介]陈悦，硕士，E-mail：824314196@qq.com

[通信作者]黄兰，副教授，博士，E-mail：lanhuang29@126.com