苏冬娜　吴诗品

(深圳市人民医院暨南大学第二临床学院感染内科，深圳518020)



Smad7修饰的骨髓间充质干细胞对肝硬化大鼠治疗及其机制研究①

苏冬娜吴诗品

(深圳市人民医院暨南大学第二临床学院感染内科，深圳518020)

[摘要]目的：探讨Smad7修饰的骨髓间充质干细胞对肝硬化大鼠的治疗作用，并对相关机制进行研究，为临床治疗方法提供理论依据。 方法：选取80只健康雄性Wistar大鼠，随机分为4组，对照组(C)：不采取任何干预措施；肝硬化组(LC)：行大鼠肝硬化模型制备；空载体转染组(Ad-eGFP-LC)：行大鼠肝硬化模型制备后给予Ad-eGFP空载体修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗；治疗组(Ad-Smad7-eGFP-LC)：行大鼠肝硬化模型制备后给予Ad-Smad7-eGFP修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗。取各组大鼠的肝脏组织，行HE染色。检测各组大鼠体重和肝湿重，血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)含量以及肝组织TGFβ1、Smad3以及Smad7 mRNA表达量。 结果：BMSCs移植入大鼠体内后，Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠肝脏组织病理学有明显改善，肝脏纤维化和干细胞变性坏死的程度明显降低；Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体重低于C组(P<0.05)，均高于Ad-eGFP-LC及LC组(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠肝湿重高于C组(P<0.05)，均低于Ad-eGFP-LC及LC组(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体内ALT、AST表达均高于C组(P<0.05)，均低于Ad-eGFP-LC及LC组(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体内Alb 及TP表达量低于C组(P<0.05)，均高于Ad-eGFP-LC及LC组(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体内TGFβ1、Smad3 mRNA表达均高于C组(P<0.05)，均低于Ad-eGFP-LC及LC组；Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体内Smad7 mRNA表达量均高于C组，Ad-eGFP-LC及LC组(P<0.05)。 结论：Smad7修饰的骨髓间充质干细胞移植入肝硬化大鼠体内可减轻疾病的发生，其机制可能与减弱TGFβ-Smad信号转导通路相关。

[关键词]Smad7；骨髓间充质干细胞；肝硬化

肝硬化是各种慢性肝病发展的晚期阶段，具有发病率高、治疗疗效差及死亡率高的特点，我国是肝硬化的高发国家，疾病严重威胁着居民的健康，给家庭和社会造成了极大地负担，因此研究肝硬化新的治疗方法十分迫切。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种具有自我更新、多向分化潜能的多能干细胞，具有多种免疫调节能力，可促进肝细胞再生、转分化为肝细胞和抑制肝纤维化，可部分恢复肝功能逆转肝硬化，是除了肝移植手术外从根本上治疗肝硬化有效途径[1]。Smad7是TGFβ-Smad信号转导通路的抑制因子，与肝硬化疾病的发生发展密切相关[2]，因此本研究观察Smad7修饰的骨髓间充质干细胞对肝硬化大鼠的治疗作用并对其相关机制进行研究。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组选取80只健康SD大鼠，体重160～200 g，均给予普通食料，在恒温、固定湿度及良好通风条件下饲养。将大鼠随机分为4组，每组20只，其中对照组(C)，不采取任何干预措施；肝硬化对照组(LC)，行大鼠肝硬化模型制备，并行开腹腔手术，注射0.4 ml PBS；空载体转染组(Ad-eGFP-LC)：行大鼠肝硬化模型制备后，开腹腔手术，腹腔注射(3～5)×106(10×106ml-1，0.4 ml)Ad-eGFP空载体修饰的骨髓间充质干细胞；治疗组(Ad-Smad7-eGFP-LC)：行大鼠肝硬化模型制备后，开腹腔手术，取(3～5)×106(10×106ml-1,0.4 ml)个Ad-Smad7-EGFP修饰的骨髓间充质干细胞，肝内多点注射。

1.1.2主要试剂携有Smad7的腺病毒(Ad-Smad7-eGFP)及增强绿色荧光蛋白腺病毒(Ad-eGFP)均由本实验构建，TRIZOL裂解液、PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)及TaKaRa SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒均购于TaKaRa公司。Smad7及β-actin抗体均购于Abcam公司。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)试剂盒均购于Life公司。

1.2方法

1.2.1肝硬化动物模型建立大鼠适应饲养1周后，进行模型试验的制备，大鼠腹腔注射四氯化碳橄榄油溶液，按标准环境饲养[3]。

1.2.2大鼠BMSCs培养及转染取2周龄、体重30～40 g雄性SD大鼠，颈椎脱位处死，在无菌条件下取出股骨和胫骨，剔除表面肌肉组织，减去骨头两端，用1 ml注射器吸取10%血清的1640培养液冲出骨髓细胞。离心细胞悬液后加入红细胞裂解液，再次离心收集细胞后重悬，调节适当的细胞密度，接种于6孔板内，置于37℃，5%的CO2孵箱中进行培养，每隔2～3 d进行换液一次。培养至12～14 d时，观察是否形成较大的细胞克隆，此时弃掉原有培养液，用PBS清洗细胞，并加入0.25%的胰蛋白酶进行消化，然后进行首次传代，直至传至第三代时，收集细胞调整细胞密度以2×105个细胞接种至六孔板,待细胞基本融合后去除培养基，以PBS清洗2次后等待转染。每孔加入Smad7或空质粒慢病毒载体和助转染剂，10 h后换液，2 d后加入新霉素进行筛选。在荧光显微镜下观察每孔绿色荧光的表达情况。

1.2.3BMSCs移植与取样制备对于Ad-eGFP-LC及Ad-Smad7-eGFP-LC鼠，在模型构建成功的第1天、第5天、第10天行尾静脉给予相关质粒慢病毒转染的BMSCs注射，对照组及肝硬化对照组在相同时间给予生理盐水注射，操作第8周时，称量大鼠体重记录，并应用10%水合氯醛(0.2 ml/kg)麻醉大鼠，取肝组织称量记录肝湿重，并-80℃保存，主动脉取血，离心取血清-80℃保存，进行后续试验。

1.2.4Real-Time RCR测定实验所需器械均经高压去RNA酶处理，并经0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理，且实验均在冰块上操作，降低温度对结果的影响。取待检测的细胞及组织，加入1 ml TRIZOL裂解5 min，一次加入三氯甲烷、异丙醇及75%乙醇进行获取RNA，10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度仪测定浓度及纯度。应用TaKaRa逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)，严格按照说明书，将提取的RNA逆转录为cDNA，并应用TaKaRa SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，进行PCR体系的扩增及反应。其中，引物序列为：β-actin： 5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′和5′-TGTGGACTTGGGAGA-GGACT-3′； TGFβ1：5′- TGCTAATGGTGGACCGCAA-3′和5′-CACTGCTTCCCGAATGTCTG-3′； Smad3：5′-ATGGAGCTCTGTGAGTTTGCCT-3′和5′-TGGAGG-TAGAACTGGCGTCTCT-3′； Smad7：5′-TTCCTCCGC-TGAAACAGGG-3′和5′-CCTCCCAGTATGCCACCA-C-3′,试验时每个样本和基因做2个相同的复孔。

1.2.5Western blot检测目的蛋白表达取待检测的细胞及组织，加入RIPA裂解液，裂解半小时，高速离心后去上清，即为蛋白提取物。应用Brdaofdr法测定总蛋白量，每孔加样量为20 μg蛋白,然后进行SDS-PAGE分离,电转移至PVDF膜,封闭后，4℃孵育相应的一抗抗体，过夜。洗液漂洗后，室温2 h孵育二抗，加入显色底物，上机检测。

1.2.6HE染色组织块脱水后石蜡包埋及切片，片厚5 μm，HE染色，光镜下观察肝细胞坏死程度。

1.2.7冰冻切片观察肝脏组织中绿色荧光表达组织冰冻包埋后，入恒冷切片机内开始进行切片，片厚18 nm，在荧光显微镜下观察切片并采图。

1.2.8肝功能检测取上清，依据试剂盒要求采用比色法，测定丙氨酸氨基转移酶(Alanine a minotransferase， ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate a minotransferase，AST)、总蛋白(Total protein，TP)、白蛋白(Albumin,Alb)，操作步骤严格按照说明书进行。

2结果

2.1各组BMSCs腺病毒转染效率鉴定腺病毒转染之后，荧光显微镜下可以清楚地观察到，空病毒Ad-eGFP转染组及Ad-Smad7-eGFP组BMSCs有明显的绿色荧光表达，而对照组无荧光表达。并且，转染之后，Ad-Smad7-eGFP组BMSCs的Smad7 蛋白及mRNA的表达水平明显高于对照组即空病毒Ad-eGFP转染组，差异具有统计学意义(P<0.05)。具体详见图1～3。

2.2移植后大鼠肝脏绿色荧光表达荧光显微镜下可见，Ad-eGFP-LC及Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠肝脏可以很容易就找到绿色荧光蛋白标记的细胞,它们主要聚集在血管、血窦及肝小叶等部位，而C组即LC组大鼠肝脏切片未见带有荧光细胞,说明BMSCs细胞成功在大鼠肝脏定植。具体见图4。

2.3移植后大鼠病理组织切片HE染色可见，Ad-eGFP-LC及LC组，肝细胞排列紊乱,坏死明显,有大量肝脏细胞发生脂肪变性，肝脏组织内有大量纤维组织生成,纤维束粗厚,有较多假小叶形成；而Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠肝脏组织病理学有明显改善，肝脏纤维化和干细胞变性坏死的程度明显降低。具体见图5。

图1　转染后BMSCs 绿色荧光表达(×200)Fig.1　Green fluorescence expression in BMSCs after transfection(×200)Note: A.Control group；B.Ad-eGFP transfected BMSCs group；C.Ad-Smad7-eGFP transfected BMSCs group.

图2　各组BMSCs Smad7的蛋白表达水平比较Fig.2　Relative Smad7 protein expression level in each group

图3　各组BMSCs Smad7的mRNA表达水平比较Fig.3　Relative Smad7 mRNA expression level in each groupNote: Vs control group,*.P<0.05;vs Ad-eGFP transfected BMSCs group,#.P<0.05.

图4　大鼠肝脏组织绿色荧光表达(×100)Fig.4　Green fluorescence expression of liver tissues(×100)Note: A.C group；B.LC group；C.Ad-eGFP-LC group；D.Ad-Smad7-eGFP-LC group.

2.4移植后大鼠体重和肝湿重BMSCs移植入大鼠体内后，Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体重低于C组，差异具有统计学意义(P<0.05)，均高于Ad-eGFP-LC及LC组，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠肝湿重高于C组，差异具有统计学意义(P<0.05)，均低于Ad-eGFP-LC及LC组，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC组大鼠体重低于C组，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC组大鼠肝湿重高于C组，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC组大鼠体重和肝湿重均无差异(P>0.05)，具体见表1。

2.5移植后体内肝功能变化BMSCs移植入大鼠体内后，Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体内ALT、AST表达均高于C组，差异具有统计学意义(P<0.05)，均低于Ad-eGFP-LC及LC组，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体内Alb及TP表达量低于C组，差异具有统计学意义(P<0.05)，均高于Ad-eGFP-LC及LC组，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC组大鼠体内ALT、AST表达均高于C组，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC组大鼠体内Alb 及TP表达量低于C组，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC组大鼠体内ALT、AST、Alb及TP表达量均无差异(P>0.05)，具体见表2。

图5　大鼠病理组织切片(×100)Fig.5　Histopathologic slide of liver sections(×100)Note: A.Control group；B.LC group；C.Ad-eGFP-LC group；D.Ad-Smad7-eGFP-LC group.

GroupsBodyweightWetweightofliverC450.7±78.910.6±7.6LC300.9±79.41)19.7±7.81)Ad-eGFP-LC319.5±82.11)18.9±7.91)Ad-Smad7-eGFP-LC400.2±84.81)2)3)14.7±6.51)2)3)

Note：Vs C,1)P<0.05;vs LC,2)P<0.05;vs Ad-eGFP-LC,3)P<0.05.

2.6移植后体内TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA表达BMSCs移植入大鼠体内后，Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体内TGFβ1、Smad3 mRNA表达均高于C组，差异具有统计学意义(P<0.05)，均低于Ad-eGFP-LC及LC组，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体内Smad7 mRNA表达量均高于C组、Ad-eGFP-LC及LC组，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC组大鼠体内TGFβ1，Smad3 mRNA表达均高于C组，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC组大鼠体内Smad7 mRNA表达均低于C组，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC组大鼠体内TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA表达量均无差异(P>0.05)，具体见图6。

图6　各组TGFβ1，Smad3，Smad7 mRNA水平比较Fig.6　Relative levels of TGFβ1，Smad3，Smad7 mRNA in each ±s,n=20)Note: Vs C,*.P<0.05;vs LC,#.P<0.05;vs Ad-eGFP-LC,&.P<0.05.

GroupsALT(U/L)AST(U/L)Alb(g/dl)TP(g/dl)C24.8±10.167.9±7.841.7±9.671.7±7.5LC120.6±11.31)139.4±7.11)22.4±8.61)44.8±6.91)Ad-eGFP-LC115.7±10.41)132.7±6.31)23.8±9.11)45.9±6.11)Ad-Smad7-eGFP-LC60.3±11.91)2)3)80.9±7.91)2)3)30.7±8.11)2)3)60.6±5.91)2)3)

Note：Vs C,1)P<0.05;vs LC,2)P<0.05;vs Ad-eGFP-LC,3)P<0.05.

3结论

肝硬化是一种以弥漫性纤维化的肝组织、再生结节和假小叶为特点的慢性疾病，是复杂的病理过程，机制至今不明，现在临床上针对性治疗仍存在诸多弊处及风险，因此寻找治疗肝硬化的替代疗法尤为重要。BMSCs是一种具有自我更新、多向分化潜能的多能干细胞，具有多种免疫调节能力，其由德国病理学家Cohnheim首次提出，发现这种贴壁细胞具有自我复制更新、高度增殖和多向分化的能力，可分化为多种骨骼及附属器官组织，参与机体的多项功能调节[4]。最新研究表明，BMSCs是一种免疫特许细胞，自身不表达主要组织相容性复合体及其他共刺激分子，具有对自然杀伤细胞及细胞毒性T细胞的逃逸功能，在骨髓抑制的替代治疗中有很大的应用前景[5]。已有研究表明，BMSCs可通过多种途径影响机体反应，针对BMSCs移植治疗可显著减轻肝硬化大鼠的发病机率，但其机制却仍未有定论。

在肝硬化发生发展过程中，肌成纤维母细胞在其中起着重要作用，可通过合成分泌多种细胞外基质(Extracelluar matrix,ECM) 导致肝脏纤维化，在这个过程中TGFβ-Smad信号转导通路起着关键作用。TGFβ1是导致肝硬化的最重要的细胞因子，其可通过以下途径导致ECM堆积：①促进ECM合成细胞大量合成ECM；②通过增强抑制ECM降解酶的活性，减少ECM的降解；③促进ECM受体的表达，从而加强ECM在体内致纤维化的作用[6,7]。Smad7是TGF-β下游的效应分子，通过与受体的结合及磷酸化介导TGF-β信号传入细胞核，作为TGFβ-Smad信号传导中重要的负性调控蛋白参与肝硬化的治病过程[8]。Smad7在肝脏中可通过抑制肝星状细胞的转录和多种胶原蛋白等细胞外基质的合成，从而达到抗纤维化作用。Smad7可通过以下方式阻断TGFβ-Smad信号转导通路：①与Smad2、3竞争结合位点，阻止Smad磷酸化，从而使信号传导受阻；②增加泛素介导的TGFβ受体的降解，中断信号通路；③减少组蛋白乙酰化来抑制信号通路中相关蛋白的转录；④Smad7可与激活的Smad竞争结合受体，阻止通路的磷酸化或多聚化，从而阻断TGFβ-Smad信号转导通路，达到抑制肝脏纤维化的作用[9,10]。

本研究可以看出，Smad7修饰的骨髓间充质干细胞移植入肝硬化大鼠后，可通过保护肝功能，降低体内炎性细胞因子分泌从而对抗肝硬化，具体表现为：①Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体重均高于Ad-eGFP-LC及LC组(P<0.05)；②Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠肝湿重均低于Ad-eGFP-LC及LC组(P<0.05)；③Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体内ALT、AST表达均低于Ad-eGFP-LC及LC组(P<0.05)；④Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体内Alb 及TP表达量均高于Ad-eGFP-LC及LC组(P<0.05)。并且，由病理切片可以看出，Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠肝脏组织病理学有明显改善，肝脏纤维化和干细胞变性坏死的程度明显降低。继续研究发现，Ad-Smad7-eGFP-LC组大鼠体内TGFβ1、Smad3 mRNA表达均低于Ad-eGFP-LC及LC组(P<0.05)，Smad7 mRNA表达量均高于Ad-eGFP-LC及LC组(P<0.05)，提示Smad7修饰的骨髓间充质干细胞可能通过调控TGFβ-Smad信号转导通路来干预肝硬化的发生与发展。

综上所述，本实验表明Smad7修饰的骨髓间充质干细胞移植入肝硬化大鼠体内可减轻疾病的发生，其机制可能与减弱TGFβ-Smad信号转导通路相关。

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[8]王燕平,贺琪,吴飞,等.Wnt3a对肝星状细胞增殖活化以及转化生长因子β/Smad表达的影响[J].中华肝脏病杂志,2013,21(2):111-115.

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[收稿2015-09-01修回2015-11-17]

(编辑倪鹏)

Experimental research of therapeutic effect of Smad7 gene modified bone marrow mesenchymal stem cells on liver cirrhosis rats

SUDong-Na，WUShi-Pin.

DepartmentofInfectiousDiseases，ShenzhenPeople′sHospital，theSecondClinicalMedicineCollege，JinanUniversity，Shenzhen518020，China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of Smad7 gene modified bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) on liver cirrhosis rats，thereby explaining the mechanism of immunoloregulation of BMSCs in vivo.Methods: 80 male Wistar rats were randomly divided into 4 groups,the control group(C),the liver cirrhosis group(LC),adenovirus Ad-eGFP transfected into liver cirrhosis group (Ad-eGFP-LC),and adenovirus Ad-Smad7-eGFP transfected into liver cirrhosis group(Ad-Smad7-eGFP-LC).And then detect HE staining,body weight and wet weight of liver;the expression of ALT,AST,TP,and Alb;the expression of TGFβ1，Smad3,and Smad7 mRNA in all groups. Results: HE staining showed that Ad-Smad7-eGFP-LCs group′s amount of pseudolobules,degree of cell degeneration and adipose degeneration was the lowest under average visual fields.The body weight in Ad-Smad7-eGFP-LCs group was lower than that in C group(P<0.05),higher than that in Ad-eGFP-LC and LC group(P<0.05);the wet weight of liver in Ad-Smad7-eGFP-LCs group was higher than that in C group(P<0.05),lower than that in Ad-eGFP-LC and LC group(P<0.05).The expression of ALT,and AST in Ad-Smad7-eGFP-LCs group was higher than that in C group(P<0.05),lower than that in Ad-eGFP-LC and LC group(P<0.05);the expression of Alb and TP in Ad-Smad7-eGFP-LCs group was lower than that in C group(P<0.05),higher than that in Ad-eGFP-LC and LC group(P<0.05);the expression of TGFβ1 and Smad3 mRNA in Ad-Smad7-eGFP-LCs group was higher than that in C group(P<0.05),lower than that in Ad-eGFP-LC and LC group(P<0.05).The expression of Smad7 mRNA in Ad-Smad7-eGFP-LCs group was higher than that in C group,Ad-eGFP-LC and LC group(P<0.05). Conclusion: Smad7 gene modified BMSCs could reduce symptoms of liver cirrhosis rats,and the mechanism maybe involve the inhibition of the signal transduction pathway of TGFβ-Smad.

[Key words]Smad7;Bone marrow mesenchymal stem cells;Liver cirrhosis

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.020

作者简介：苏冬娜(1977年-)，女，硕士，主治医师，主要从事感染性疾病临床及基础研究，E-mail:sudona@qq.com。通讯作者及指导教师：吴诗品(1963年-)，男，博士，主任医师，主要从事感染性疾病临床及基础研究，E-mail:wupoem@126.com。

中图分类号R657.3+1

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0692-05

①本文为深圳市科创委立项课题20140320101246。