周福荣　付志强　钱世鹍

(广州医科大学附属第二医院,广州510260)



大鼠免疫器官中CD103+CD4+/-树突状细胞的分布和形态学观察

周福荣付志强钱世鹍

(广州医科大学附属第二医院,广州510260)

[摘要]目的：针对树突状细胞功能差异，探讨CD103+CD4+亚群在大鼠各级免疫器官中的分布与形态差异。方法：运用双重免疫组化及免疫荧光双标记法通过CD103及CD4对树突状细胞各亚群进行标记，通过光镜、荧光倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察树突状细胞各亚群的含量、分布和形态。结果：肠系膜淋巴结中CD103+DC约占其内细胞总数的1.7%,胸腺次之约1.2%,脾脏最少约0.98%。不同部位各亚群DC的形态也存在一定差异，胸腺及肠系膜淋巴结DC大多数为CD4-CD103+DC且形态不规则有较长突起。脾脏CD4-CD103+DC核小而不规则，突起较细小。结论：大鼠各级免疫器官中各树突状细胞亚群存在分布及形体差异，这一差异可能与其在迁移分化过程中在各级免疫发挥不同调节功能有关。

[关键词]树突状细胞;免疫器官;免疫荧光;免疫组化

树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是一类专职的抗原提呈细胞，在机体免疫调节中发挥着重要作用。这群细胞中有些可以诱导机体对异体抗原产生特异性免疫应答；有些可以诱导机体对特异性抗原的免疫耐受。近年研究发现，树突状细胞的功能差异主要是因为在体内树突状细胞存在不同亚群[1]。但要确切肯定某一表型与其功能的关系依然受到诸多困扰。首先是因为DC在其发育成熟过程中存在迁移、表型和形态变化，其次依照机体各级免疫调节器官发挥作用不同也影响了不同DC亚群的分布，再次目前大多实验在体外进行不能完全反映机体真实情况，亦可能因实验因素导致表型与形体改变[2，3]。因此，我们希望通过对大鼠生理状态下各免疫器官中DC亚群的分布、形体特点的调查，为今后深入研究病理状态下各DC亚群表型与功能提供基础数据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物Sprague-Dawley雄性大鼠20只，6～8周龄，180～200 g/只，购于广东省实验动物中心。按SPF级动物饲养标准饲养，适应环境1周。实验前禁食6 h，腹腔注射水合氯醛过量麻醉处死大鼠，立即取胸腺、脾及肠系膜淋巴结放入10%中性福尔马林溶液中固定备用。

1.1.2主要试剂小鼠抗大鼠CD103单克隆抗体(eBioscience)。兔抗CD4多克隆抗体(Santa Cruse公司)。Alexa Fluor 488 羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 594 羊抗小鼠 IgG(BD phar mingen)。DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)(AppliChem公司)。DouSPTM免疫组化双染试剂盒、液体DAB酶底物显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.2方法

1.2.1双重免疫组织化学将固定、包埋好的组织切成5 μm石蜡切片并贴于防脱玻片上，常规脱蜡，梯度酒精水化。3%H2O2室温处理20 min。抗原修复：柠檬酸缓冲液(0.01 mmol/L，pH6.0)微波炉高火5 min，中低火15 min。用PBS冲洗后加入一抗37℃孵育30 min。冲洗后加入生物素化二抗37℃孵育30 min后加入碱性磷酸酶复合物37℃孵育45 min， BCIP/NBT显色5 min。冲洗后加入第二种一抗37℃孵育30 min。再次加入第二种生物素化二抗37℃孵育30 min后加入过氧化物酶复合物37℃孵育30 min，DAB显色10 min。染色后用光学显微镜观察计数并拍照。

1.2.2双标免疫荧光标记同1.2.1方法固定、包埋、脱蜡、水化制成5 μm石蜡切片。正常山羊血清封闭液室温封闭20 min，抗原修复方法同1.2.1。吸去血清加入一抗混合液(CD103、CD4稀释度分别为1∶50、1∶200)湿盒内4℃过夜。冲洗后加入二抗Alexa Fluor 594 羊抗小鼠 IgG(1∶200)37℃避光孵育30 min，再次冲洗后加入二抗Alexa Fluor 488羊抗兔 IgG、(1∶200)37℃避光孵育30 min，DAPI(1 μg/ml)室温避光孵育15 min，滴加抗荧光衰减封片剂封片。分别在荧光显微镜及激光共聚焦显微镜下计数及进行形态学观察并拍照。

1.2.3树突状细胞各亚群计数及统计学处理每张切片取10个高倍视野，CD103+DC及CD4+/-DC亚群的含量=免疫组织化学(或免疫荧光)标记阳性细胞数/该视野内细胞总数×100%。

2结果

2.1各免疫器官中树突状细胞亚群的分布胸腺中CD103+DC约占胸腺细胞总数的1.2%，脾脏中CD103+DC约占脾脏细胞总数的0.98%，肠系膜淋巴结中CD103+DC约占肠系膜淋巴结细胞总数的1.7%。表1、2分别用免疫组化法和免疫荧法检测的CD4+CD103+DC和CD4-CD103+DC在各免疫器官中占细胞总数百分比。免疫组化和免疫荧光检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各免疫器官中树突状细胞的形态 胸腺DC(Thymus DC，TDC)主要分布在胸腺皮髓交界处及髓质。CD4+CD103+DC细胞较规则，突起小且细，核大而圆；CD4-CD103+DC细胞大小不一，形态不规则，有较长突起(见图1)。脾脏DC(Spleen DC，SDC)分布较分散无明显集聚区，白髓和红髓内均可见散在DC，CD4+CD103+DC异源性大，细胞大而不规则，核相对较小，突起较细小；CD4+CD103+DC中等大小，核浆比高，核规则(见图2)。肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph nodes，MLN)内DC主要分布于副皮质区和淋巴滤泡内，树突状细胞两亚群CD4+CD103+DC核小而不规则，细胞质较多，突起细小。CD4-CD103+DC核大而圆，胞浆少，突起较长(见图3)。

CD103+CD4+DC1)CD103+CD4+DC(%)2)CD103+CD4-DC1)CD103+CD4-DC(%)2)T5.00±1.500.32±0.088.00±2.300.75±0.07S7.00±1.600.43±0.047.00±1.800.41±0.06MLN3.00±1.000.24±0.0827.00±5.401.59±0.06

Note：T.The thymus；S.The spleen；MLN.Mesenteric lymph nodes；1)show the number of DC subsets in tissue sections at per high power lens;2)show the percentage of DC subsets in tissue sections at per high power lens.

CD103+CD4+DC1)CD103+CD4+DC(%)2)CD103+CD4-DC1)CD103+CD4-DC(%)2)T5.00±1.400.33±0.0613.00±3.100.87±0.06S7.00±1.900.35±0.087.00±2.000.38±0.02MLN3.00±1.300.19±0.0722.00±4.601.33±0.47

Note：T.The thymus;S.Spleen；MLN.Mesenteric lymph nodes;1)show the number of DC subsets in tissue sections at per high power lens;2)show the percentage of DC subsets in tissue sections at per high power lens.

图1　大鼠胸腺CD103+CD4+/-树突状细胞形态的免疫组化和免疫荧光分析Fig.1　Detecting morphology of CD103+CD4+/-dendritic cells in rat thymus by immunohistochemistry and fluroresence immunohistochemistryNote: A.Thymus immunohistochemistry photos(×400):brown arrow for CD103+,blue arrow for CD4+;B.Thymus immunofluorescence images(×400):the green for CD103+ ,the bright red for CD4+，yellow arrow for CD103+ and CD4+ ;C.Thymus laser confocal images(×630):red arrow for CD103+ CD4-DC,yellow arrow for CD103+ CD4+ DC.

图2　大鼠脾脏CD103+CD4+/-树突状细胞形态的免疫组化和免疫荧光分析Fig.2　Detecting morphology of CD103+CD4+/-dendritic cells in rat spleen by immunohistochemistry and fluroresence immunohistochemistryNote: A.Spleen immunohistochemistry photos (×400):brown arrow for CD103+,blue arrow for CD4+;B.Spleen immunofluorescence images(×400):the green arrow for CD103+ ,the bright red arrow for CD4+，yellow arrow for CD103+ and CD4+ ;C.Spleen laser confocal images(×630):red arrow for CD103+ CD4-DC,yellow arrow for CD103+ CD4+ DC.

图3　大鼠肠系膜淋巴结CD103+CD4+/-树突状细胞形态的免疫组化和免疫荧光分析Fig.3　Detecting morphology of CD103+CD4+/-dendritic cells in rat MLNs by immunohistochemistry and fluroresence immunohistochemistryNote: A.Thymus immunohistochemistry photos (×400):brown arrow for CD103+,blue arrow for CD4+;B.Thymus immunofluorescence images(×400):the green for CD103+ ,the bright red for CD4+，yellow arrow for CD103+ and CD4+ ;C.Thymus laser confocal images(×630):red arrow for CD103+ CD4-DC,yellow arrow for CD103+ CD4+ DC.

3讨论

树突状细胞是一个异质性群体，大量的研究表明这种异质性主要与其在体内存在不同的亚群有关。在对大鼠树突状细胞的研究中，CD103是公认的标记大鼠DC的标记方法[1,2]。在体外实验发现CD103+DC根据是否表达CD4表面抗原可以分成两个功能和形体各异的两种DC亚群[4-6]。在本次实验中我们通过CD103、CD4对胸腺、脾及肠系膜淋巴结组织切片中DC进行标记，对体内生理状态下的DC两亚群的分布及形体学进行直接观察。本实验避免了体外实验对DC亚群分布及形体的干扰，使结果更接近DC在体内的真实情况。

该实验通过对免疫组化免疫荧光标记结果进行统计学计数分析我们发现不同免疫器官中CD103+DC的分布不均,肠系膜淋巴结中含量最为丰富约占其内细胞总数的1.7%,胸腺次之约1.2%,脾脏最少约0.98%且肠系膜淋巴结DC和胸腺DC均以CD4-CD103+DC为主分布，分别占细胞总数的1.33%和0.86%，这种差异可能与其在免疫调节过程中行使的功能有关，研究发现胸腺作为免疫调节的中枢器官在中枢耐受中发挥着主要作用，并且肠系膜淋巴结在口服耐受和自身耐受中发挥着主要作用[7]。这可能导致这些器官中某种调节免疫耐受的DC亚群含量相对占优势，我们认为这种存在于胸腺和肠系膜淋巴结中的DC亚群可能是CD103+CD4-DC。而对于脾脏来说，其主要参与机体的免疫应答，因此表现出CD4-DC的含量相对较少。另外，这种差异还可能与其起源有关在对小鼠胸腺基质细胞的研究中发现,胸腺中约50%的DC是由外周DC迁移而来的,这些DC包括CD11b+CD8-cDCs[8]。在大鼠中与CD11b+CD8-cDCs功能相近的DC亚群为CD4+CD103+DCs,可能在大鼠中的CD4+CD103+DCs也是迁移性的DC,导致其在胸腺中含量较少，本实验所得的CD4+CD103+MLN DC及CD4-CD103+MLN DC的相对含量分别为0.19%±0.07%和1.33%±0.47%;与Turnbull等[9]通过免疫磁珠对肠系膜淋巴结各DC亚群分选结果CD4+CD103+DC在肠系膜淋巴结中很少,大多数为CD4-CD103+DC的描述相近,但他们并未给出确切的数据Cecile Voisine等[5]将新提取的脾脏经过做成细胞悬液并运用免疫磁珠筛选发现脾脏中CD103+DC的CD4+/-两亚群所含比例相近,我们在对脾脏中DC亚群的含量研究发现CD4+CD103+DC约占脾脏内细胞总数的0.35%，CD4-CD103+DC含量约为0.38%,结果相似。此外，不同免疫器官中DC的形态也不尽相同。胸腺CD4+CD103+DC及脾脏CD4+CD103+DC细胞较规则，核浆比高，核规则，但脾脏DC形态较小；肠系膜淋巴结CD4+CD103+DC核小而不规则，核浆比小，有细小的树突。胸腺及肠系膜淋巴结CD4-CD103+DC细胞形态不规则，核浆比大，均有较长突起；而脾CD4-CD103+DC核浆比相对较小，突起较细小。我们认为这种形态学上的差异可能是因为胸腺和肠系膜淋巴结由于要对各种不同的抗原保持一定强度的耐受处于相对较为活跃的状态，所以树突较粗且长;而对于脾脏主要是在机体受到病原微生物入侵等情况时功能才会活跃起来，在稳态下，这一产生特异性免疫应答的功能并未表现出来，以致于其内的树突状细胞也表现为一种未激活的状态，细胞显得小而树突少。

本次实验研究对CD4+/-CD103+DC在大鼠各级免疫调节器官中的分布情况有了较为全面的了解，这在以前的研究中是未有的，本研究的结果将有助于我们在病理状态下进一步探究各级免疫器官如何调整CD4+/-CD103+DC亚群进行免疫调节。

参考文献：

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[收稿2015-08-07修回2015-08-28]

(编辑张晓舟)

Observation of distribution and morphology of rat CD103+CD4+/-dendritic cells in immune organs

ZHOUFu-Rong,FUZhi-Qiang,QIANShi-Kun.

TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510260，China

[Abstract]Objective:For the functional differences in dendritic cell subsets,the study gains insight into the distributional and morphological differences of rat dendritic cells in immune organs.Methods: Immunohistochemical staining and Immunofluorescent staining were perfomed to study the morphology and the distribution of rat dendritic cells by DC marker(including CD103 and CD4).Results: In Mesenteric lymph nodes CD103+ DC accounted for about 1.7% of its total number of mononuclear cells,followed by about 1.2% in the thymus and least in spleen about 0.98%.There were certain differences among DC in different immune organs.The majority of TDCs were CD4-CD103+DC,the morphology of CD4-CD103+T DCs and MLN DCs was irregular and long dendrites could be observed .In MLN most of CD4-CD103+DCs contain a large,round nucleus and with relatively long dendrites.The nuclei of CD4-CD103+DCs were small and irregular while their dendrites was smaller.Conclusion: That the distribution and morphology of the subsets of dendritic cells in different immune organs being not identical may be related to the subsets of dendritic cells playing different regulatory functions in the process of migration and differentiation in immune organs.

[Key words]Dendritic cell；Immune organ；Immunofluorescence；Immunohistochemistry

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.012

作者简介：周福荣(1987年-),男,在读硕士,主要从事肝癌外科及肿瘤生物学治疗研究，E-mail：1010047185@qq.com。通讯作者及指导教师：钱世鹍(1964-)，男，博士，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事肝癌外科及肿瘤生物学治疗研究，E-mail：qiansk@qq.com。

中图分类号R392.12

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0656-04