刘琳　高子芬　李敏　刘校龙　刘翠苓　李艳



EB病毒阳性的胃弥漫大B细胞淋巴瘤特点及预后

刘琳①高子芬②李敏②刘校龙②刘翠苓②李艳①

摘要目的：探讨EB病毒阳性患者的胃弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）病理学特点及预后。方法：回顾性分析北京大学基础医学院病理学系2009年1月至2015年1月75例胃弥漫大B细胞淋巴瘤患者的临床资料，15例EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）阳性者为病例组，60例EBV阴性者为对照组，采用免疫组织化学法和EB病毒RNA探针原位杂交法检测Bcl-2、c-myc蛋白表达及EBV-EBER情况，分析EBV阳性的胃DLBCL患者的病理学特点及预后。结果：EBV阳性组在临床表现、年龄、性别、起源、细胞形态等方面与EBV阴性组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；在Bcl-2、c-myc蛋白表达方面，EBV阳性组与EBV阴性组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；R-CHOP方案治疗下，EBV阳性组与EBV阴性组相比，中位总生存期（median overall survival，OS）分别为15.1个月和31.4个月，差异具有统计学意义（P=0.01）。结论：发生于胃DLBCL患者中，EB病毒感染对临床表现、瘤细胞的起源、形态、蛋白表达等方面无明显影响；EB病毒阳性的DLBCL患者并不局限于老年人；R-CHOP治疗下EB病毒阳性患者的预后比EB病毒阴性的患者预后差。

关键词弥漫大B细胞淋巴瘤胃肿瘤EB病毒预后

作者单位：①中国医科大学附属第一医院血液科（沈阳市110000）；②北京大学基础医学院病理学系

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常见的类型，大多有很强的侵袭性，预后不佳。胃肠道是最常见的结外发生部位，占肠道淋巴瘤的62.6%［1-2］。胃的DLBCL在起源、治疗、预后方面存在争议［3］，所以研究胃DLBCL的特点尤为重要。近年来，研究提示EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染可能对DLBCL的发生、蛋白表达、基因异常及预后存在一定影响［4-5］，所以本研究通过比较EBV阳性和EBV阴性的胃DLBCL患者的临床表现、年龄、性别、瘤细胞起源、蛋白表达、增殖指数、总生存时间等的差异，分析EBV感染对胃DLBCL的影响。

1　材料与方法

1.1临床资料

回顾性分析北京大学基础医学院病理学系2009 年1月至2015年1月75例胃DLBCL患者的临床资料，EBV阳性者15例为病例组，EBV阴性者60例为对照组。依据2008年WHO造血与淋巴组织肿瘤分类标准，至少由2位血液病理学专家进行诊断或复核，均明确诊断为胃DLBCL。30例经标准R-CHOP方案治疗的患者经过3～67个月的随访，中位随访时间28个月。本研究经过被研究对象或其家属知情同意及符合人体试验委员会所制定的伦理学标准并得到伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1研究方法采用EnVision二步法，3～5 μm厚组织置于APES胶片上，经过烤片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，3%双氧水封闭，Tris-EDTA修复液（pH=9.0）高压修复，TBS洗后加入一抗（CD20、CD79a、PAX5、CD3ε、Ki-67、CD10、Bcl-6、Bcl-2、c-myc、GCET-1、FOXP-1、Mum-1），37.0℃孵育1 h，TBS洗后加入兔/鼠通用二抗37.0℃孵育40 min，DAB显色后，Mayer苏木素复染，脱水、透明、封片。

严格按EBV-EBER探针试剂盒说明书进行原位杂交，3～5 μm厚组织脱蜡、脱水后蛋白酶K消化20 min，100%乙醇干燥，加入EBER探针杂交液，贴封口膜，37.0℃孵育3 h，TBS洗后揭膜，加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP），37.0℃孵育40 min，DAB显色，甲基绿复染对比染色。所用抗体Dako购自上海拜力生物科技有限公司，EBV-EBER探针购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TBS与苏木素均购自北京天合立恩生物科技有限公司。

1.2.2结果判读CD20、CD10均为细胞膜阳性，CD79a为胞膜及胞质阳性，Ki-67、Bcl-6、c-myc、FOXP-1、Mum-1、PAX5均为细胞核阳性，CD3ε、GCET-1、Bcl-2均为细胞质阳性；c-myc阳性标准为≥40%，Bcl-2阳性标准为≥70%［6-7］，判断是否为双重表达淋巴瘤时也按此标准判定。

EBV-EBER原位杂交中，以瘤细胞核内出现棕褐色颗粒为阳性信号。EBER阳性标准为20%［5，8］。阳性对照采用EBER阳性的鼻型NK/T细胞淋巴瘤的病例。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验及Fisher确切概率法；数值的比较采用独立样本t检验；应用Kaplan-Meier描述生存曲线，采用Log-rank检验比较生存曲线差异。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1EBV阳性的DLBCL临床及病理学特点

本研究所有患者均无明确的免疫缺陷病史，均无黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤（extranodal marginal zone lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue，MALToma）病史，因不同程度的胃痛或胃胀就诊。在年龄≥50岁和年龄＜50岁、性别、B症状上将两组进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05），由于多数患者消瘦是由于胃部不适、食欲不佳所致，故本研究将有无盗汗、发热（体温超过38.0℃）为判断有无B症状的标准；在形态方面，两组从肿瘤细胞起源（Choi模型）、瘤细胞形态、是否伴有坏死、腺体破坏、MALToma成分方面进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1　EBV阳性与EBV阴性组临床及病理学特点比较Table 1　Comparison of clinical and pathological characteristics between EBV-positive and EBV-negative groups

2.2胃DLBCL中EBV阳性与EBV阴性的Bcl-2、c-myc表达情况的比较

全部病例均经免疫组织化学法及RNA原位杂交法检测Bcl-2、c-myc、EBV-EBER的表达情况，见图1。分别分析了Bcl-2、c-myc单独表达、双重表达的情况，阳性标准按以往文献中的标准判读［6-7］。EBV阳性组Bcl-2、c-myc的单独表达与EBV阴性组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。近年来，在DLBCL患者中，研究越来越关注双重打击淋巴瘤的诊治，所以为避免偏倚及节约经费，首先选用免疫组织化学法初步分析双表达的情况，在c-myc和Bcl-2同时表达时，EBV阳性组与EBV阴性组相比，差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

图1　EBER阳性的胃DLBCL患者的Bcl-2、c-myc、EBER的表达（SP×400）Figure 1 Expression of Bcl-2，c-myc，and EBER in EBER-positive gastric DLBCL patients（SP×400）

表2　EBV阳性组与EBV阴性组Bcl-2、c-myc表达情况的比较Table 2 Comparison of expression of Bcl-2 and c-myc in EBV-positive and EBV-negative groups

2.3胃DLBCL中EBV阳性与EBV阴性增殖指数的比较

采用独立样本t检验比较两组差异，EBV阳性组（75.0±4.33）与EBV阴性组（79.1±1.94）相比，差异无统计学意义（P=0.35）。

2.4R-CHOP方案下胃DLBCL中EBV阳性组与EBV阴性组总生存时间的比较

由于R-CHOP方案是DLBCL的标准治疗方案，本研究对75例患者中30例经标准R-CHOP方案治疗的患者成功进行了随访，其余患者或选用了其他治疗方法，如CHOP化疗、手术切除、中医疗法。EBV阳性组和EBV阴性组中位OS分别为15.1个月和31.4个月，EBV阳性组中位OS明显短于EBV阴性组中位OS（P=0.01），见图2。为了排除年龄的影响，本研究又将年龄≥50岁的患者分为老年组，年龄＜50岁的患者为年轻组，分别进行了分析。老年组中EBV阳性组中位OS和EBV阴性组中位OS分别为17.8个月和30.4个月，差异无统计学意义（P=0.12）。年轻组中，EBV阳性组中位OS和EBV阴性组中位OS分别为8.5个月和33.7个月，EBV阳性组中位OS短于EBV阴性组中位OS，差异具有统计学意义（P=0.01）。

图2　EBV阳性组和EBV阴性组中位生存时间比较Figure 2 Median survival time of EBV-positive and EBV-negative groups was compared

3　讨论

DLBCL是非霍奇金淋巴瘤中最常见的类型，瘤细胞形态呈多形性或单形性，侵袭性强，总体预后不佳［9］。DLBCL可以发生在全身多个系统，其中结外部位以胃部最常见，但是发生于胃的DLBCL在胃部肿瘤中罕见，发生率不足5%。2008年WHO分类中，有一种类型称为EBV阳性的老年弥漫大B细胞淋巴瘤，临床上无明确的免疫缺陷病史，如移植、激素应用等；形态上表现为多形性或单一性大细胞增生浸润，常伴有地图样坏死。WHO将这种疾病的年龄段界定在年龄≥50岁，但是近年来部分研究提示［4-5］，一些无免疫缺陷的DLBCL的年轻患者（年龄＜50岁）也会存在EBV感染。故本研究集中收集75例胃部DLBCL的患者进行分析，发现EBV阳性的患者中有5例年龄＜50岁为33.3%（5/15），最小者为10岁，这5例患者既往均无HIV感染、风湿病、移植及激素使用史等，并且在形态、蛋白表达水平上与年龄≥50岁的患者类似，这与以往的研究相符［10］。所以，以往用年龄相关的免疫缺陷来解释DLBCL出现EBV阳性的情况并不充足，EBV阳性老年DLBCL发生在儿童原因还有待研究［11-12］。在年龄方面，本研究以50岁为界限，将EBV阳性组同EBV阴性组进行对比，差异无统计学意义（P=0.51）。所以在胃DLBCL患者中，EBV阳性的DLBCL并不只发生于老年人群。

在DLBCL患者中，EBV感染占10%左右，常伴随免疫缺陷。研究证实［13-14］EBV感染本身可以导致多种肿瘤，如伯基特淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，淋巴系统增殖性疾病等，它可以通过促进c-myc基因过表达，激活NF-κB，JAK/STAT，PI3K/AKT通路促进肿瘤的发生，但是在无免疫缺陷的DLBCL病例中，EBV的作用仍有待研究［12］。在胃肠肿瘤中，EBV也可以通过影响基因表达促进肿瘤的发生［15］。为明确EBV对胃DLBCL的影响，本研究对比了两组的症状、性别、瘤细胞起源、形态、增殖指数，差异无统计学意义（P＞0.05），与以往报道相符［5，16］。所以胃DLBCL中EBV感染对临床表现、性别、细胞形态、MALToma成分、起源、增殖指数无明显影响。

伴随分子生物学诊断水平的研究深入，研究发现DLBCL患者中出现c-myc（+）/Bcl-2（+）或少见的c-myc（+）/Bcl-6（+）或c-myc（+）/Bcl-2（+）/Bcl-6（+）的“双重打击”或“三重打击”淋巴瘤时，预后尤其差［16-17］。即使在标准方案R-CHOP治疗下，也未能改善预后［17］。“双重打击”、“三重打击”淋巴瘤确诊需要基因学的检测，本研究因病例数有限，未能深入进行。但有研究提示［8，16］，即使蛋白水平出现“双重表达”的情况，预后也较差，这一观点已逐渐达成共识。为明确“双重表达”淋巴瘤是否与EBV感染有关，本研究从蛋白水平分析了Bcl-2，c-myc表达与EBV的关系。研究发现无论单独表达还是同时表达，双重表达淋巴瘤出现的情况与EBV感染无关（P＞0.05），这与以往的研究相符。因此，本研究推测胃DLBCL中，Bcl-2，c-myc蛋白表达与EBV感染无关。

R-CHOP是目前治疗DLBCL的标准方案，疗效优于其他方案。本研究随访30例R-CHOP治疗的患者，将EBV阳性组和EBV阴性组相比，中位OS分别为15.1个月和31.4个月，所以在EBV感染状态下胃DLBCL的预后较差（P=0.01），这与一项韩国的研究相符［4］。但后者认为在R-CHOP治疗下的DLBCL患者中，EBV对年轻组患者（年龄＜50岁）的OS无影响，而老年组（年龄≥50岁）EBV阳性患者预后较差，以往国内和国外的研究［18-19］均认为在老年组中，EBV对OS无影响。本研究将30例患者按年龄是否超过50岁分为老年组和年轻组分别分析。在老年组中，EBV阳性组和EBV阴性组中位OS分别为17.8个月和30.4个月，差异无统计学意义（P=0.12），这与以往国内和国外的研究相符［18-19］；年轻组中EBV阳性组中位OS和EBV阴性组中位OS分别为8.5个月和33.7个月，EBV阳性组中位OS明显短于EBV阴性组中位OS （P=0.01）。由于年轻人EBV阳性的DLBCL发生例数少，所以该结论缺乏相关文献支持。本研究推测，EBV阳性的胃DLBCL患者预后要比EBV阴性的患者预后差。

综上所述，目前已不能将EBV阳性的DLBCL当做仅发生于老年人或免疫缺陷者的疾病，年轻、无免疫缺陷者也可能发生。EBV对于DLBCL患者的临床表现、肿瘤细胞的特点、蛋白表达情况均无明显影响，但对于“双重表达”淋巴瘤的研究，还需进一步扩大样本量。R-CHOP治疗下，EBV阳性患者比EBV阴性患者预后差。具体原因还需进一步深入做基因水平的研究。

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（2016-01-27收稿）

（2016-02-20修回）

（编辑：孙喜佳校对：杨红欣）

刘琳专业方向为血液病肿瘤的基础与临床研究。

E-mail：lin5891859@163.com

Characteristics and prognosis of EBV-positive gastric diffuse large B-cell lymphoma

Lin LIU1，Zifen GAO2，Min LI2，Xiaolong LIU2，Cuiling LIU2，Yan LI1

Correspondence to: Yan LI；E-mail:liyan2@medmail.com.cn

1Department of Hematology，The First Hospital Affiliated to China Medical University，Shenyang 110000，China；2Department of Pathology，School of Basic Medical Science，Peking University，Beijing 100000，China

AbstractObjective: To investigate pathological characteristics and prognosis of patients with Epstein-Barr virus（EBV）positive gastric diffuse large B-cell lymphoma（DLBCL）.Methods: Through retrospective study，we collected 75 cases of patients with DLBCL that occurs in the stomach.The patients were divided into two groups consisting of 60 cases of EBV negative control group and 15 cases of EBV positive group.To analyze the pathological characteristics and prognosis of patients with EBV positive gastric DLBCL，immunohistochemical and Epstein-Barr encoding region（EBER）in situ hybridization methods were used to detect Bcl-2，c-myc protein expression，and EBV-encoded RNA（EBER）.Results: In certain aspects of clinical manifestations，such as age，gender，and origin，the comparison between EBV-positive and EBV-negative groups had no statistically significant difference.The same results were obtained for Bcl-2 and cmyc protein expression.However，a statistically significant difference（P=0.01）was observed under the R-CHOP regimen where the median overall survival（OS）of the EBV-positive and EBV-negative groups were 15.1 and 31.4 months，respectively.Conclusion: In patients with DLBCL of the stomach，the EBV infection had no obvious effects in terms of clinical manifestation，origin，morphology，and protein expression of tumor cells.EBV-positive DLBCL was not limited to elderly patients.Under the R-CHOP regimen，the prognosis of EBV-positive patients was worse than that of EBV-negative patients.

Keywords:diffuse large B-cell lymphoma，gastric neoplasms，Epstein-Barr virus，prognosis

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.06.100

通信作者：李艳liyan2@medmail.com.cn

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