孙　波，刘嘉婧，刘晓阳，孙亚娟，周庆伟，权　威，陈加俊*

(1.吉林大学药学院,吉林 长春130021；2.吉林省食品药品认证中心；3.吉林大学中日联谊医院 神经内科)



*通讯作者

新的肿瘤抑素对C6脑神经胶质瘤体外实验研究

孙波1，刘嘉婧2，刘晓阳3，孙亚娟3，周庆伟1，权威3，陈加俊3*

(1.吉林大学药学院,吉林 长春130021；2.吉林省食品药品认证中心；3.吉林大学中日联谊医院 神经内科)

神经胶质瘤是颅内最常见的原发肿瘤，呈浸润性生长，且术后复发率高，严重威胁患者的生命健康。目前神经胶质瘤的发病机制尚未十分清楚，据文献报道，神经胶质瘤的发生、发展与细胞凋亡密切相关[1-3]。其传统的治疗原则是术后先放疗后化疗，或单独放疗/化疗，但都难以提高其临床疗效[4]，治愈率仍较低。近年来，研究者们通过大量的基础研究正在寻求治疗脑神经胶质瘤的新策略。目前国内外已研究出的抗肿瘤药物众多，但多数价格昂贵且不良反应大，同时也存在耐药性问题，使其临床应用受到一定限制[5-7]。为此，寻找高效、低毒、价廉的新的治疗药物成为近年来研究的热点。本实验旨在研究一种新的肿瘤抑素对C6脑神经胶质瘤细胞作用的影响，并通过检测神经胶质瘤细胞侵袭及细胞周期蛋白D1表达变化，初步探讨其抑制神经胶质瘤细胞的可能作用机制，为进一步研究新的肿瘤抑素在临床上治疗神经胶质瘤提供了新的理论依据。

1材料与方法

1.1细胞、主要试剂及药品

1.2主要仪器

(1)倒置显微镜 NiKon ECLIPSE 80i (日本尼康公司)；(2)二氧化碳培养箱 (日本 三样电机株式会社制造 产品型号：NCO-15AC)；(3) AN YANG 超净台 (中国 苏州安洋科技发展有限公司 型号：BSC-BOOⅡB2)；(4) Transwell24板由美国Corning Incorporated生产；(5) 酶标仪(中国 上海BIO-RAD公司，MODEL550型)；凝胶成像系统(中国 深圳市宇德立生物科技有限公司，170-8170)。

1.3Transwell小室侵袭实验法检测细胞侵袭能力(1) 将Martrigel基质胶与DMEM在4冰箱预冷，将Martrigel基质胶与DMEM按1∶7比例充分混匀后加入Traswell小室中，每孔200 μl，置入37℃培养箱20 min，将上层培养基吸出；(2) 取对数生长期C6肿瘤细胞消化﹑计数为5×104，每小室加入100 μl细胞悬液后，随机分为5组，分别为正常对照组，卡莫司汀组，及不同浓度新的肿瘤抑素(1 000 μg/ml﹑1 500 μg/ml﹑2 000 μg/ml)组。(3) 将30%培养液通过孔隙加入下层中，每孔500 μl。置入37℃、5%CO2孵箱，培养48 h；(4) 弃去上下层培养基，Transwell小室上下层各加入10%甲醛500 μl室温固定20 min,弃去,500 μl PBS洗两次后，上下层各加400 μl，1%结晶紫，20 min后弃去结晶紫。上下层各用PBS洗2次，末次不弃。(5) 显微镜下拍照。

1.4Western Blot检测细胞周期蛋白-D1的表达

(1)取对数生长期C6神经胶质瘤细胞，0.25%胰酶消化计数。调整细胞悬液1×106Cells/ml接种六孔板中，1 ml/孔,37℃、5% CO2培养4 h，(2) 实验分组(见方法2.1)，每组设3个复孔，除正常对照组外，其余每孔加不同的药物均为500 μl，每孔终体积2 ml。置入37℃，5% CO2培养48 h；(3)冰上裂解提取细胞总蛋白，采用BSA蛋白定量检测试剂盒测定所提取蛋白的浓度；(4)取50 μg蛋白上样量，经15%的SDS-PAGE电泳，采用电转印法将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜；(5)膜在5%脱脂奶粉封闭 1 h，加兔抗鼠Cyclin-D1(1∶300)，4℃摇床封闭过夜；(6)TBST洗涤15 min×3次，加入羊抗兔二抗(1∶3 000)，室温孵育60 min；(7)TBST洗涤15 min×3次，取等体积ECL显色A液和B液，加到PVDF膜上，处理1 min后，将膜放入凝胶图像仪，曝光5 min，特异性条带的信号采用凝胶图像分析系统处理。蛋白表达灰度值=各组条带的灰度值/对应的β—actin条带的灰度值

1.5统计学分析

2结果

2.1Transwell小室实验结果不同浓度新的肿瘤抑素对C6神经胶质瘤细胞侵袭能力具有不同程度的抑制作用。其中新的肿瘤抑素(1 500μg/ml，2 000μg/ml)组及卡莫司汀组与正常对照组比较具有统计学意义(P<0.05)；卡莫司汀组与新的肿瘤抑素(2 000μg/ml)剂量组比较无统计学意义(P>0.05)(见表1及图1)。

表1　　　　新的肿瘤抑素对C6神经胶质瘤细胞侵袭能力的

#P<0.05，与正常对照组比较;※P>0.05，与卡莫西汀组比较

2.2新的肿瘤抑素对细胞周期蛋白-D1表达的影响

Western Blot结果显示，不同浓度的新的肿瘤抑素对C6神经胶质瘤细胞周期蛋白-D1的表达具有一定的调节作用，正常对照组与新的肿瘤抑素各组及卡莫西汀组比较均具有显著性差异(P<0.05)，同时也显示，新的肿瘤抑素(2 000 μg/ml)组与卡莫西汀组比较无统计学意义(P>0.05)。结果表明新的肿瘤抑素对细胞周期蛋白-D1的表达具有一定的调节作用 (见表2及图2)。

图1　Transwell小室实验结果

表2　　　新的肿瘤抑素对细胞周期蛋白D1表达的

*P<0.05，与正常组比较,ΔP>0.05,与卡莫西汀组比较

图2　Western Blot检测结果

3讨论

近年来，恶性肿瘤发病率呈现逐年攀升的趋势，在脑肿瘤中以恶性胶质瘤的发病率升高最为明显[8]，约占颅内肿瘤的35-60%以上[9]。由于该病的发病机理目前仍不清楚，故其治疗一直没有重大突破。目前主要通过手术治疗，并联合化疗、放疗以减少肿瘤的复发及转移，但其治愈率仍较低，对其治疗至今尚无突破性进展。故对于神经胶质瘤的有效治疗手段已成为临床研究的热点。

据文献报道，国内外已研究出的抗肿瘤药物众多，但多数价格昂贵且不良反应大，同时也存在耐药性问题，使其临床应用受到一定限制[10-12]。为此，寻找高效、低毒、疗效稳定的抗肿瘤药物是目前研究开发的重点，而多肽药物恰恰具备了这些优点。另有研究报道，增殖和侵袭是恶性肿瘤最为明显的生物学特征，也是恶性肿瘤难以治愈的根本原因。如何抑制恶性肿瘤增殖和侵袭对控制恶性肿瘤进展具有重要意义[13-15]。

本实验采用Transwell小室侵袭实验法检测细胞侵袭能力。结果显示，新的肿瘤抑素(1 500 μL/mL)﹑新的肿瘤抑素(2 000 μL/mL)组分别与正常对照组比较均具有显著性差异(P<0.05)。这表明新的肿瘤抑素对C6神经胶质瘤细胞具有明显抑制其侵袭的作用。

多项研究表明，细胞生长周期为G1→S→G2→M期，在此细胞周期中，G1→S期、G2→ M期被认为是关键点，并且G1→S期对细胞的增殖存在重要影响。Cyclin-D1作为G1期细胞周期素，在G1/S期转换中发挥重要作用[16]。生理状态下，细胞进入S期后Cyclin-D1迅速分解，若Cyclin-D1基因激活并持续高表达，则导致G1期缩短，提前进人S期，继而导致遗传基因突变和染色体结构异常的细胞获得增殖能力，引发细胞增殖失控，最终形成肿瘤[17]。本研究为进一步探讨新的肿瘤抑素对细胞周期及细胞周期蛋白-D1表达的影响。同时采用Western blot检测，结果也证实了不同浓度的新的肿瘤抑素对C6脑神经胶质瘤细胞的细胞周期蛋白-D1的表达有一定的调节作用，新的肿瘤抑素(1 500 μl/ml)、新的肿瘤抑素(2 000 μl/ml)组及卡莫西汀组与正常对照组比较均具有显著性差异(P<0.05)，新的肿瘤抑素(2 000 μg/ml)组与卡莫西汀组比较无统计学意义(P>20.05)。结果证实，新的肿瘤抑素可能通过下调细胞周期蛋白D1的表达，抑制C6神经胶质瘤细胞侵袭能力。本研究为新的肿瘤抑素治疗神经胶质瘤的临床应用提供了新的实验依据。

参考文献：

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C6脑神经胶质瘤细胞株：购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

主要试剂：(1) 结晶紫由天津光复精细化工研究所生产；(2) 新的肿瘤抑素由本研究室设计，由上海吉尔公司合成，纯度为98%；(3)卡莫司汀由天津金耀药业有限公司生产(批号：1407011)；Rabbit Anti—Cyclin-D1、HRP羊抗兔IgG、Anti-beta-Actin均由武汉博士德生物工程有限公司生产；PageRuler预染蛋白Ladder由赛黙飞世尔科技(中国)有限公司生产；RIPA裂解液由碧云天生物技术研究所(中国)生产。

基金项目：吉林省发展和改革委员会课题项目(JF2012C008_4)

文章编号：1007-4287(2016)05-0707-03

作者简介：孙波(1965-)，男，副教授，主要从事药理学研究;陈加俊，教授，研究方向：神经病学。

(收稿日期：2015-11-19)