石琳胡延萍王建科王钧许小宁李毅王莉

（1. 中国科学院西北高原生物研究所，西宁 810001；2. 中国科学院大学，北京 100049；3. 青海省县镇企业技术组厂站，西宁 810008）

云生毛茛ISSR-PCR体系优化与引物筛选

石琳1，2胡延萍1王建科1，2王钧1，2许小宁3李毅1王莉1

（1. 中国科学院西北高原生物研究所，西宁 810001；2. 中国科学院大学，北京 100049；3. 青海省县镇企业技术组厂站，西宁 810008）

旨在建立稳定可靠的云生毛茛ISSR-PCR反应体系。采用正交试验设计方法，对影响云生毛茛ISSR-PCR扩增结果的Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA五个因素进行优化筛选，对反应程序进行优化，建立适用于云生毛茛的最佳反应体系和扩增程序，并对反应体系和扩增程序进行验证；在此基础上筛选多态性好的ISSR引物，采用梯度法筛选各个引物的最适退火温度。结果表明，云生毛茛20 μL ISSR-PCR的最佳反应体系为：模板DNA 30 ng，Mg2+1.95 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.04 U/μL，dNTP 0.150 mmol/L，引物 0.5 μmol/L；最佳反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性20 s，49.6-60.6℃复性1 min，72℃延伸100 s，38个循环；72℃下延伸6 min。在优化的反应体系和反应程序条件下，从100条ISSR引物中筛选获得16条ISSR扩增引物，并确定了引物各自的最适退火温度。经过不同居群云生毛茛的验证，证明优化后体系扩增条带清晰且重复性好，可用于后续云生毛茛遗传多样性的研究。

云生毛茛；ISSR-PCR；正交实验设计；体系优化；引物筛选

云生毛茛（Ranunculus nephelogenes var. nephelogenes）为毛茛科（Ranunculaceae）毛茛属（Ranunculus Linn.）多年生草本，生长于海拔2 210-4 800 m的高山草甸、沼泽草甸、河滩、湿地等处，在我国主要分布于甘肃、青海、云南、四川、西藏和新疆等省区［1］。同时云生毛茛是祁连山湿地主要的挺水植物之一，在祁连山湿地水土保持和气候调节中占据重要地位。……