陈韵牛纯青宋小双苏畅华子春刘堰

（1. 重庆西南大学生命科学学院，重庆 400715；2. 南京大学医药生物技术国家重点实验室，南京 210093）

DSPAα1缺失突变体在毕赤酵母中的表达及活性研究

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（1. 重庆西南大学生命科学学院，重庆 400715；2. 南京大学医药生物技术国家重点实验室，南京 210093）

吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus salivary plasminogen activators，DSPAs）共有4种：DSPAα1、α2、β及γ。其中，DSPAα含有指形区（F）、表皮生长因子区（E）、kringle区（K）和丝氨酸蛋白酶区（P），DSPAβ含E、K、P区，DSPAγ含K和P区。以DSPAα1为基础，研究其结构对纤溶活性的影响。采用重叠延伸PCR技术（splicing overlap extension PCR，SOE-PCR）获得缺失E区的DSPAα1突变体（mDSPAα1），分别构建mDSPAα1/pPIC9K、DSPAβ/pPIC9K和DSPAγ/pPIC9K重组质粒并转化到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株GS115中表达，纤维平板法测活。结果显示未检测到DSPAγ的表达，DSPAα1活性为2.64×105U/mg，DSPAβ的活性为1.32×104U/mg，mDSPAα1活性为151.52 U/mg；同时使用DSPAα1、mDSPAα1、DSPAβ时，总活性几乎不受影响，单独使用任意两者时，发现活性均降低2-3倍。mDSPAα1纤溶活性几乎没有，同时DSPAβ与野生型DSPAα1相比保留了相当的催化活性。DSPAα1的N端区域可以影响其溶栓活性，而缺失E区后几乎丧失活性，说明E区在DSPAα1溶栓过程中起着至关重要的作用。

DSPAα1；SOE-PCR；缺失突变体；毕 赤酵母；纤维平板法

吸血蝙蝠唾液中含有可以帮助吸血动物进食的纤溶酶原激活剂，称为吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（DSPAs）。研究发现DSPAs有4种形式，分别为：DSPAα1、α2、β及γ。 其 中，DSPAα1和 DSPAα2包含信号肽、指形区（F）、表皮生长因子区（E）、kringle区（K）和丝氨酸蛋白酶区（P），而DSPAβ缺乏F，DSPAγ缺乏F和P。DSPAs与组织性纤溶酶原激活剂（t-PA）相似，但是不含t-PA分子的K2区和纤溶酶切割位点［1，2］。

DSPAs 与t-PA不同，对纤溶酶原的激活严格要求血纤蛋白作为辅助因子，DSPAs的纤维蛋白依赖性及纤维蛋白选择性需要其与纤维蛋白结合来介导，与F区有关［3］。……