王利锋 袁芳 乐涛 秦建波 何红秋

无创基因检测在胎儿染色体非整倍体诊断中的应用

王利锋 袁芳 乐涛 秦建波 何红秋

目的 评价无创基因检测在胎儿染色体非整倍体诊断中的临床应用价值。方法 选取253例高龄孕妇，在知情同意的原则下采集外周血血浆,对其血浆中胎儿游离DNA进行检测；并与实验孕妇的羊水染色体核型分析结果进行比对验证。结果 本试验对253例样本进行了孕妇血浆胎儿游离DNA检测，检出21-三体阳性病例3例，检出18-三体阳性病例1例，与染色体核型分析的结果一致。结论 无创基因检测可以用于胎儿染色体拷贝数异常的检测，具有无创、灵敏度高、特异性强等优点，在胎儿染色体拷贝数异常疾病的产前检测中具有临床实际应用的价值。

高龄孕妇；染色体非整倍体异常；胎儿游离DNA；无创产前诊断

染色体非整倍体异常是指染色体数目不是相应染色体组基数整倍数的状态，其新生儿发病率约1‰～2‰。常以21、18、13-三体较为常见。其中以21-三体综合征(又称唐氏综合征，Down’s syndrome或先天愚型)最为常见，新生儿发病率大约为1/600～1/800［1］。患儿通常都存在学习障碍、智能障碍或伴有脏器畸形等问题。目前对于该疾病的临床检测方法或假阳性比例较高，或存在一定的流产、致畸风险，这使得患者依从性较差［2］，导致许多21、18、13-三体等非整倍体患儿出生。

随着孕妇外周血中胎儿游离DNA逐渐被学者们证实，利用胎儿游离DNA进行无创产前检测越来越受到关注。该方法具有无创取样、无流产风险、高灵敏度及准确性的特点［3］，可作为现有产前诊断技术的有益补充。在既往研究中，该方法常与唐氏血清学筛查方法进行比较，而与染色体核型分析方法进行比较的研究较少。本研究拟采用前瞻性研究策略，选取253例高龄孕妇，在早中孕期（孕13～26周）开展cff-DNA检测，通过与临床金标准技术-染色体核型分析进行比较，来对无创基因产前检测技术的临床应用价值进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象 收集2013年2月～2014年5月重庆渝中地区因高龄妊娠和产前筛查高风险等要求无创产前基因检测的早、中孕期单胎孕妇253例，年龄35～46岁，孕周13～26周，平均（19.9±0.6）周。在知情同意的原则下采集孕妇静脉血5mL，EDTA抗凝。

1.1.2 试剂与仪器 DNA提取试剂盒（天跟生化科技有限公司），T4多聚核苷酸激酶、Klenow DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶（德国Qiagen公司）；Ampure Beads试剂盒（美国BeckmanCoulter公司），2100 Bioanalyzer（美国Agilent公司），Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide Kit（Illumina公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取血浆DNA 将孕妇静脉血于4℃、1600r/ min,离心10min，收集血浆后4℃、1600r/min，离心10min，取上层血浆，分装，-80℃保存。以上操作在抽血后6h内完成。参照DNA提取试剂盒操作说明书提取血浆中的DNA。

1.2.2 高通量测序文库制备 (1)T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶将获得的DNA片段修复成平末端、加“A”、加接头、PCR富集，最终获得用于高通量测序的DNA文库。(2)使用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库质量进行分析，并使用real-time定量PCR对文库进行精确定量。按照要求进行混合文库（即Pooling）。

1.2.3 DNA测序 用Pooling后的文库，经C-bot桥式反应扩增，在Illumina HiSeq平台进行大规模基因并行测序，获得约百万条短DNA序列reads。经ELAND软件将测序的数据与Ensemble数据库的人类基因组参考序列进行比对，获得已去重复序列的参考序列上唯一位置的21、18、13号染色体的数目。每个样本原始数据不得少于5×106个序列数，比对后获得的唯一序列不得少于2×106个序列数。结果判断标准参照文献［4］，每一母体血浆样本中21、18、13号染色体序列数目与总的序列数目的比值。通过计算样本待测染色体的比例与总体人群的比率之差，除以正常孕妇群染色体的标准方差，所得为Z值，若Z值大于或等于3，即认为待测样本为三体高危；反之若小于或等于3，则为单体高危。

1.2.4 胎儿染色体核型确诊方法 采集上述早、中孕期单胎孕妇253例孕妇的羊水，由医院妇产科产前诊断中心经细胞培养后G显带，再使用Video Test-Karyo 3.1(美国)全自动染色体分析系统进行染色体核型分析。

2 结果

2.1 胎儿“21-三体综合征”无创基因检测 检测出21-三体阳性样本3例，阴性样本250例。染色体核型分析结果检测出21-三体阳性样本3例，阴性样本250例。与临床金标准—核型分析相比，胎儿“21-三体综合征”无创基因检测的21-三体检出率为100.00%，21-三体假阴性率为0.00%，21-三体假阳性率为0.00%，正确百分率为100.00%。见表1。

表1 21-三体两种检测方法的结果

2.2 胎儿“18-三体综合征”无创基因检 测检测出18-三体阳性样本1例，阴性样本252例。染色体核型分析结果检测出18-三体阳性样本1例，阴性样本252例。与临床金标准—核型分析相比，胎儿“18-三体综合征”无创基因检测的18-三体检出率为100.00%，18-三体假阴性率为0.00%，18-三体假阳性率为0.00%，正确百分率为100.00%。见表2。

表2 18-三体两种检测方法的结果

3 讨论

无创产前遗传学诊断是妇产科基础研究和临床工作的关注热点。目前常用的产前筛查和诊断方法有：临床上14～20孕周进行的“唐氏综合征”血清学筛查、超声NT筛查、羊水穿刺检查、和脐带血穿刺。血清学筛查法通过检测孕妇外周血生化指标综合计算出21-三体、18-三体及13-三体的发病概率，临床上各种生化筛查方法的检出率仅为66%～80%不等（包括二联、三联、四联筛查），漏检20%～34%不等，且假阳性率高［5］，每100个唐筛高危的患者，仅有不到1%是真正的唐氏儿；超声检查高度依赖于检测设备分辨率和医生个人经验，难以形成统一的标准，且超声检查是对发育异常严重的畸变类型进行的诊断，对超声指标不明确或有争议的发育异常仍无法判断。有创产前诊断技术（羊水穿刺检查、脐血穿刺）准确率高，为临床的金标准，但有创取样有0.5%～2%的流产风险及1%左右的致畸风险［6］，且容易导致破水、羊膜腔炎、阴道出血、胎儿刺伤、呼吸窘迫等并发症。其中文献报道的羊水穿刺、胎儿脐带血穿刺的流产率分别为0.5%和2%［7］。

与目前临床常用的筛查和诊断方法相比，胎儿染色体非整倍体无创基因检测技术具有早孕期检测、无创取样、无流产风险、高灵敏度以及高准确度的特点［8］，另外胎儿DNA在孕早期就可以检测到，且分娩后很快被清除，不会受到前次妊娠的影响，且不影响再次妊娠［9］。因此，对孕妇外周血中胎儿游离DNA的检测及其临床应用研究将对无创性产前基因检测技术的发展产生重大影响。

本研究共检测253例样本，检测出21-三体阳性样本3例，阴性样本250例；18-三体阳性样本1例，阴性样本252例。与临床金标准—核型分析结果相比，胎儿无创基因检测的21-三体和18-三体检出率为100.00%，假阴性率为0.00%，假阳性率为0.00%，正确百分率为100.00%。

从以上数据中可以看出，运用胎儿“21-三体综合征”无创基因检测筛查21、18-三体与临床核型结果之间无统计学差异，符合临床检测要求，其敏感性、特异性与核型分析技术具有较高的一致性。本技术具有无创性、高准确性、高通量等优势，具有临床实际应用价值。建议针对高龄、高危孕妇，选取个体化的产前诊断策略，在早孕期充分利用cff-DNA检测等新兴高端技术，对胎儿染色体非整体异常做到早检测、早诊断、早干预。至于在低危孕妇中的应用，以及能否彻底代替唐氏血清学筛查，则需要更多卫生经济学方面的研究。

[1] Chang YW,Chang CM,Sung PL,et al.An overview of a 30-year experience with amniocentesis in a single tertiary medical center in Taiwan[J].Taiwan J Obstet Gynecol,2012,51(2):206-211.

[2] 郭晓丽，赵悦淑.高龄羊水穿刺的原因分析及对策[J].中国妇幼保健，2013，28(23):3875-3876.

[3] Lau TK,Chen F，Pan X,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of common fetal chromosomal aneuploidies by maternal plasma DNA sequencing[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2012,25(8):1370-1374.

[4] Jiang F，Ren J，Chen F，et al.Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test:an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodologyfor fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies[J].BMCMed Genomics,2012,5:57.

[5] Malone FD,Canick JA,Ball RH,et al.First-and second-Trimester screening,or both,for down's syndrome[J].N Engl J Med,2005,353(19):2001-2011.

[6] 戚庆炜,蒋宇林,周希亚,等.6584例高龄孕妇妊娠中期羊水染色体核型分析结果[J].中华围产医学杂志,2013,16(2):76-77.

[7] Albery MS,Soothill PW.Non-invasive prenatal diagnosis:Implications for antenatal diagnosis and mansgement of high-risk preguancies[J].Seminars in Fetal & Neonatal Medicine,2008(13):84-90.

[8] Bianchi DW,Platt LD,Goldberg JD,et al.Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing[J].Obstet Gynecol,2012,119(5):890-901.

[9] Smid M,Galbiati S,Vassallo A,et al.No evidence of fetal DNApersistence in maternal plasma after pregnancy[J].Hum Genet,2003,112(5-6):617-618.

Objective To validate the clinical value of noninvasive gene Detection in fetal chromosomal aneuploidy diagnosis. Methods A total of 235 pregnant women with advanced maternal ages were screened for maternal plasma cell-free fetal DNA (cff-DNA) examination, and the results were then confirmed by karyotype analysis. Results Of the 253 women examined, cff-DNA screening detected chromosomal aneuploidy in 4 cases, including trisome-21 in 3 cases, trisome-18 in 1 case as confirmed subsequently by karyotype analysis. Conclusion Noninvasive gene examination is efficient for detecting fetal chromosomal aneuploidies, and is non-invasive highly sensitive and specific. It therefore has a practical clinical value.

Advanced maternal age; Chromosomal aneuploidy; Cell-free fetal DNA; Non-vasive prenatal diagnosis

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.6.003

国家自然科学基金 （81202438） 重庆市科技攻关重点项目（CSTC2012ggb10002）

重庆 400030 重庆市肿瘤研究所 （王利锋） 401320 重庆市护士学校 （袁芳） 401123 重庆市科学技术研究院 （乐涛 秦建波 何红秋）

王利锋 E-mail:24102989@qq.com