张慧儒 吕会新 康希 林丽霞

茯苓多糖抗2型糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化作用研究

张慧儒 吕会新 康希 林丽霞

目的 研究茯苓多糖抗2型糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化的作用。方法 雄性大鼠60只，通过喂养制作2型糖尿病肾病模型，通过常规结扎左侧输尿管制作肾纤维化模型。随机分为4组，即空白对照组和3组不同的茯苓多糖剂量组。并取其尾部静脉血，测定尿素氮、肌酐、白蛋白等情况，并收集24小时尿液测定其尿蛋白定量；之后分别给予空白对照组、A组、B组、C组，茯苓多糖0 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg、12 mg/kg的剂量灌胃，喂养5周后取24 h尿液，测定24小时尿蛋白定量。实验结束后取尾部静脉血，测定尿素氮、肌酐、白蛋白，并迅速打开腹膜后取出肾脏。梗阻侧取经肾门正切的肾组织用10%甲醛溶液固定、常规方法制备切片。结果 茯苓多糖喂养大鼠前后可以使大鼠的血肌酐、24小时尿蛋白含量水平均减低，血浆白蛋白增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；组间比较不同浓度的茯苓多糖对以上生化指标均有改善，茯苓多糖与血肌酐之间的变化发现，二者呈正相关关系（r=3.207，P＜0.05)；肾间质病理学提示肾小管减少、管腔内蛋白管型、肾间质内弥漫性纤维化的数目以及肾间质内淋巴细胞浸润的数目均明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 茯苓多糖可以防治大鼠的肾间质纤维化。

茯苓多糖；糖尿病肾病；肾间质纤维化；尿蛋白；血肌酐

茯苓(wolfiporia cocos wolf)别名松苓、云苓，为一种菌类，它寄生在松树根上，属于多孔菌科茯苓(wolfiporia)，非褶菌目(aphyllophorales)，茎可做药用。从外观看茯苓很像甘薯，它的外皮是黑褐色，里肉是粉红色或白色。其原生物大多生长于赤松或马尾松的根部。茯苓的气味甜、淡，性平，当作药用具有利水渗湿、有益于胃和脾、养心安神的功用。菌核的70%～90%都是茯苓多糖，它主要由线型β(1，3)－D－葡聚糖组成。研究发现，茯苓具有提高机体抵抗能力，明显的抵抗肿瘤浸润、延缓衰老、保护肝功能的作用[1]。李绪亮等[2]报道茯苓多糖(pachymaran，PPS)对慢性肾脏病具有保护肾功能、延缓肾衰进展的作用。本文旨在研究茯苓多糖对2型糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美国Sigma公司，货号S 0130)；茯苓多糖(江西康道生物有限公司)；24小时尿蛋白定量及生化指标(日立全自动生化分析仪，型号7108)测定；肾组织病理有具有多年经验的病理检验师双盲法查看。肾病理检查采用：（1）脱水机(湖北孝感，ZT-12 P 2)；（2）包埋机(湖北孝感，TB-718)；（3）冷台(湖北孝感，TB-718)；（4）切片(德国莱卡，RM 2126 RT)；（5）烤片(湖北孝感，TB-718)；（6） 染色；（7）显微镜（德国莱卡，DM 750）。

1.2 实验动物与分组 由河北医科大学动物实验中心提供的SD大鼠，合格证号为：42000500001560。动物许可证：SJZSDYYY（冀）2003-0002。选SD大鼠60只，体质量（260±20）g，随机分为4组，空白对照组15只，每天仅给予普通饲料喂养，不应用茯苓多糖；A组（n=15）：给予3 mg/kg的茯苓多糖(由宁波德康生物制品有限公司提供)；B组（n=15）：给予6 mg/kg的茯苓多糖；C组（n=15）：给予12 mg/kg的茯苓多糖。4组大鼠一般资料差异无统计学意义，具有可比性。

1.3 肾组织病理学观察 光镜：切片厚度3 μm，均常规进行苏木素伊红染色(HE)、马松染色(Masson)、过碘酸雪夫染色(PAS)。由多年具有肾病理经验的病理师采用双盲法进行检测。

1.4 试验方法 适应性饲养5 d后，均收集24小时尿液，测定24小时尿蛋白定量，并取尾部静脉血，测定尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白蛋白(ALB)等化验指标。A、B、C 3组大鼠均给予高糖高脂(在普通饲料中加入2.5%的胆固醇、0.4%胆酸钠、10%蔗糖、10%猪油)饲料喂养。2周后禁食12 h，腹腔内注射1%STZ溶液35 mg/kg，4周后糖尿病肾病模型成立。实验室内温度为

22℃～25℃，室内湿度为30%～40%，每天喂食2次，即每天的6:00、18:00各喂食1次，每天更换1次饮水和垫料。4周末用代谢笼收集小鼠24 h尿液，测定24小时尿蛋白定量(Upr)，取大鼠的尾部静脉血，测定尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白蛋白(ALB)等化验指标。5周后结扎左侧输尿管制作肾纤维化模型，并迅速取出肾脏。梗阻侧取经肾门正切的肾组织用10%甲醛溶液固定、常规方法制备切片。

1.5 统计学方法 所有数据均采用SPSS统计软件17.0处理。计量资料采用“x±s”表示；组内比较采用配对比较的t检验，组间比较采用多个样本均数间每两个均数比较的Newmankeuls检验，指标间相关性比较用two-way ANONA检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 茯苓多糖对大鼠生化指标的影响比较 C组BUN治疗后显著降低（P＜0.05），A组和B组BUN变化不明显，A、B、C 3组消失Scr、ALB以及Wpr指标经过治疗均存在显著变化（P＜0.05），随着茯苓多糖剂量的提高，BUN、Scr、ALB、及24小时尿蛋白定量各项生化指标均明显改善，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 4组大鼠服用不同剂量的茯苓多糖前、后生化指标的变化（s）

表1 4组大鼠服用不同剂量的茯苓多糖前、后生化指标的变化（s）

组别例数时间BUN (mmol/L) Upr (g/d)对照组1520.2±5.5210.4±10.230.2±9.42.1±0.8 A组15治疗前21.5±5.5212.5±11.130.0±12.32.0±0.5治疗后18.3±4.5180.3±12.035.2±6.41.8±0.5 B组15治疗前20.5±6.2210.2±13.432.5±9.12.0±0.4治疗后19.5±6.2120.5±11.338.2±4.31.0±0.3 C组15治疗前22.7±5.5212.2±10.231.8±6.32.1±0.3治疗后15.2±2.5118.2±14.241.5±2.40.8±0.3 Scr (μmol/L) ALB (g/L)

2.2 不同剂量的茯苓多糖对大鼠肾间质病理的影响 通过茯苓多糖喂养大鼠后，各组间肾间质出现了显著的病理变化，3组小鼠肾小管数量均出现减少情况，均出现管腔内蛋白管型、肾间质弥漫纤维化、间质的淋巴细胞浸润，A组肾小管数量减少、管腔内蛋白管型、肾间质弥漫纤维化、间质的淋巴细胞浸润数目显著大于B组和C组（P＜0.05），C组患者肾小管数量减少、管腔内蛋白管型、肾间质弥漫纤维化、间质的淋巴细胞浸润数目显著低于B组和A组（P＜0.05）。见表2。

表2 服用不同剂量的茯苓多糖后3组大鼠肾病理变化情况（s）

表2 服用不同剂量的茯苓多糖后3组大鼠肾病理变化情况（s）

PPS (mg/kg)例数肾小管数量减少(个)间质的淋巴细胞浸润A组1520±619±519±719±6 B组1513±413±512±412±4 C组156±26±26±26±2 Hc6.014.55.67.2 P值＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05管腔内蛋白管型(个)肾间质弥漫纤维化(个)

2.3 不同剂量茯苓多糖与肾功能之间的关系 通过比较茯苓多糖与血肌酐之间的变化发现，二者呈正相关关系（r=3.207，P＜0.05)；BUN与茯苓多糖剂量之间没有明显关系(r=0.019,P＞0.05)。

3 讨论

茯苓多糖具有抗氧化、抗肿瘤作用已被大量实验所证实。李燕凌等[3]通过分光光度法证实了茯苓多糖具有抗氧化作用。候安继等[4]应用40只大鼠，随机分为老龄对照组、茯苓多糖组3 mg/ kg、6 mg/kg、9 mg/kg 4组，10天后发现，超氧化物歧化酶组(T-SOD、Cu-SOD)均明显升高，MDA含量降低，并具有一定的量效关系；雄性小鼠分别给予不同浓度茯苓多糖，结果发现喂养茯苓多糖组小鼠的鼻孔入水时间以及死亡时间均延长，而且随着茯苓多糖剂量的增加两个时间也不同程度的延长，说明茯苓多糖具有抗衰老作用。它的许多作用日渐被人们所认识。

茯苓多糖还可以增强机体的抵抗力。彭小彬等[5]曾报道茯苓多糖对50只小鼠，分为5组即正常对照组、正常对照+茯苓多糖组、环磷酰胺组、环磷酰胺+茯苓多糖组(50 mg)、环磷酰胺+茯苓多糖组(100 mg)，10天后发现，喂饲茯苓多糖组IgG、IgM、IL-4、IL-4 mRNA明显高于正常对照组，而环磷酰胺组上述指标明显降低，环磷酰胺+茯苓多糖组较单用环磷酰胺组上述指标升高，并且升高幅度与茯苓多糖用量大小有关，用量大的升高的要高。以上试验说明茯苓多糖可以增强机体抗病能力。慢性肾脏间质纤维化是大多数慢性肾脏疾病进行性加重的一个共同的病理过程，是导致慢性肾功能衰竭的共同的病理基础。本研究中我们发现茯苓多糖应用前后尿素氮浓度变化不大，考虑与尿素氮受饮食等影响比较多有关，与肌酐可以明显改善，提高白蛋白浓度，延缓肾衰的进展，并且与茯苓多糖的浓度具有正相关关系。

本研究发现茯苓多糖具有抑制慢性肾脏间质纤维化、延缓肾衰进展的作用，并且随着茯苓多糖的剂量增加抑制作用逐渐加强。它可以使肾间质小管数量减少，管腔内蛋白管型减少，肾间质纤维化数目减少，肾间质淋巴细胞浸润减少，使肾间质纤维化的改变相应的均减轻，推测茯苓多糖具有超过氧化物歧化酶，以及多糖分子上具有还原性的半缩醛羟基，该基团与活性氧自由基发生氧化还原作用，与OH氢原子结合成水有关。在以往研究中，沈晓燕[6]等报道茯苓多糖还可以通过抑制TGF-β具有抗肝脏纤维化作用。肾间质纤维化是慢性肾功能衰竭的一个必经过程，到了这一步几乎所有的肾功能不可逆转，但该课题为我们指明了思路，可以借用中成药来延缓肾衰的到来。本研究还发现茯苓多糖对肾脏生化的影响，它可以降低蛋白尿，增加血浆白蛋白含量，保护肾功能，为我们以后药物的选择提供了理论依据。

[1] 梁亦龙 曾垂省,王允,等.茯苓多糖的抗氧化作用[J].江苏农业科学,2012,40(7):288-289.

[2] 李绪亮,焦庆才,陈群,等.慢性肾功能衰竭的防治作用[J].中国药学杂志,2005,40(12):908-911.

[3] 李燕凌,张志旭,胡令,等.茯苓多糖抗氧化性研究[J].天然产物研究与开发,2012,24(8):1126-1128.

[4] 候安继,陈腾云,彭施萍,等.茯苓多糖抗衰老作用研究[J].中药药理与临床,2004,20(3):10-11.

[5] 彭小彬,邱小惠,余传林,等.茯苓多糖对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠体液免疫功能的影响[J].中药药理与临床,2013,9(5):69-72.

[6] 沈晓燕,胡艳,周维,等.羧甲基茯苓多糖抗大鼠实验性肝纤维化作用的研究[J].中国民族民间医药,2009,22(20):9-10.

Objective To investigate the influence of the Pachymaran on the renal interstitial fibrosis in the diabetic rats. Methods 60 male rats were fed to make type 2 diabetic nephropathy model,and renal fibrosis model was made by conventional ligation of left ureter. Rats were randomly divided into blank control group and three groups of different doses of the polysaccharide. The tail vein blood was collected urea nitrogen,creatinine, albumin,and 24 h urine samples. then were given in the blank control group,group A,group B,group C,pachyman 0 mg/kg,3 mg/kg,6 mg/kg, 12 mg/kg dose irrigation gastric. After 5 weeks of feeding,24 h urine was taken,and urine protein was measured for 24 hours. After the end of the experiment,the blood was taken from the tail vein,the urea nitrogen,creatinine and albumin were determined. Fixed with 10%formaldehyde solution, the conventional method of obstructed kidney from renal hilar tangent sections. Results Serum creatinine,a24-hour urine protein levels were lower by pachymaran,serum albumin was increased,the difference was statistically significant (P＜0.05);Pachymaran comparison between groups with different concentrations of the above biochemical indexes were improved,and the change of polysaccharides found between serum creatinine,both positively correlated (r=3.207,P＜0.05);reduction in renal tubules interstitial pathology prompt,intra-luminal protein casts,renal interstitial the number of diffuse fibrosis and the number of renal interstitial infiltration of lymphocytes were significantly reduced,with significant differences (P ＜0.05). Conclusion The pachymaran can prevent the renal interstitial fibrosis of the diabetic rats.

Pachymaran;Diabetic nephropathy;Renal interstitial fibrosis;Urinary proteinuria;Creatinine

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.8.001

石家庄市科学技术研究与发展指导计划项目 （141462943）

河北 300000 河北省石家庄市第一医院肾内科 （张慧儒 康希）河北省石家庄市第一医院药剂科 （吕会新） 河北省石家庄市第一医院营养科（林丽霞）