秦海斌　温 海



应用新型LAMP检测技术诊断犬副流感病毒感染

秦海斌温 海

注：本项目系公安部应用创新计划项目（2007YYCXNJJQS161）及公安部技术交流培训计划项目

犬传染性呼吸系统疾病，即“犬窝咳”是由多种细菌、病毒引起的，以发热、咳嗽、流涕及呼吸困难等为临床特征的犬类呼吸道感染性疾病，其中犬副流感病毒CPIV是主要致病微生物之一。CPIV属于副粘病毒科副粘病毒属，为单链不分节的负链 RNA 病毒，编码8 个结构蛋白。迄今为止，CPIV感染已波及全世界，在我国亦出现了普遍流行的趋势，病毒可广泛感染伴侣犬、实验犬和军警犬，主要表现为发热、流涕和咳嗽，也可引起急性脑脊髓炎和脑内积水，临床表现为后驱麻痹和运动失调等症状，不仅严重危害犬类的健康生长，在军犬和警犬中还能导致嗅觉障碍。

CPIV的病原学诊断以病毒分离、免疫荧光、血清学诊断、血凝/血凝抑制试验、RT-PCR、胶体金快速检测试纸条等方法为主，上述方法在灵敏度、准确性、特异性、时效性上存在一定缺陷，临床诊断中仍缺乏一种简便、快速、准确、灵敏、特异的诊断方法。环介导等温扩增技术是一种新型的恒温核酸扩增方法，在恒温条件下40～60min即可完成核酸扩增反应，与其他的检测技术相比，具有灵敏、特异、稳定、方便快捷、不需要特殊设备、结果判断直观的特点。本文利用LAMP检测技术，建立了快速检测CPIV病毒的LAMP检测方法，并采集了2015年“犬窝咳”流行期间的发病犬鼻拭子25份，对LAMP检测方法的临床诊断性能进行了初步应用和评价，现将结果报告如下：

一、 LAMP检测方法的建立

表1　CPIV-LAPM引物名称及序列

（二）RNA模板的制备：以本实验室保存CPIV细胞培养物为阳性对照，对临床样本进行检测，RNA采用TaKaRa RNA提取试剂盒进行标准提取。

（三）LAMP检测体系：LAMP反应总体积25 μL，5μL引物（1 μmol/L的F3，1 μmol/L的B3，8 μmol/L的FIP，8 μmol/L的BIP，4 μmol/L的LB，上述引物各1μL）、2.5 μL 10×ThermoPol反应缓冲液、4.0 μL 5.0 mmol/L Betaine、4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs mixture、1μL （8 U） Bst DNA polymerise、1μL AMV（5 U/μL），5μL RNA模板，ddH2O补足体积到25μL。

（四）反应温度的优选：LAMP方法在60℃～65℃范围内均能实现高效的扩增，本文选择63℃作为反应温度，在LAMP实时浊度检测系统LA-320中进行扩增，通过扩增速率曲线、扩增产物柱状图判定引物及检测体系的优劣。图1结果显示63℃下的扩增的速率曲线良好，25～35min为扩增发生时间，45min内已经完成全部扩增，因此将反应条件优选为63℃恒温扩增45min。

图1 CPIV阳性样本的LAPM扩增速率图

图2 CPIV-LAPM特异性鉴定柱1，CPIV GN株；2，CDV GN株；3，CAV GN株；4，CIV NJ株；5，BB-ATCC31124株；6，阴性对照。

二、LAMP特异性鉴定

针对“犬窝咳”中的主要致病微生物，提取CPIV GN株、CDV GN株、CAV GN株、CIV NJ株、BBATCC31124株的RNA/DNA，进行特异性验证。图2结果显示，本文中建立的LAMP方法除了阳性对照物CPIV GN株的RNA能够发生有效扩增外（柱1），对其他病原无扩增（柱2、3、4、5、6均为阴性扩增），方法具有良好的特异性。

三、灵敏度验证

提取CPIV GN株的RNA，测定RNA浓度，然后进行10倍倍比稀释作为样本系列进行LAMP扩增，图3结果显示，RNA稀释至105倍后仍然能够扩增出条带，以提取的RNA初始浓度为12.3μg/mL计算，本方法的检测极限为0.62pg，灵敏度高。

四、LAMP结果可视化效果检测

分别以CPIV GN株和蒸馏水作为阳性和阴性对照，在LAMP体系中按照1∶100的比例向LAMP反应管中加入SYBR Green I，扩增完成后在紫外照光下观察本方法的目视化效果。图4显示阳性扩增产物可发出绿色荧光，阴性对照不发出荧光，证明本方法具备良好的目视化检测能力。

五、与RT-PCR诊断方法的比较和应用

以CPIV GN株和蒸馏水作为阳性和阴性对照，对25份临床病料应用LAMP、RT-PCR方法进行检测，比较两者的符合率和检出率的高低，表2显示，两种方法的阳性、阴性符合率分别为81.8%、87.5%，LAMP方法在25分样本中检测出11份阳性样本，比RT-PCR具备更高的检出率。

图3 CPIV-LAPM灵敏度鉴定1-8为CPIV GN株RNA由100稀释至10-7。

图4 CPIV-LAPM目视化检测效果鉴定1、2为CPIV GN株；3、4为蒸馏水阴性对照。

表2　CPIV-LAPM与RT-PCR诊断效果比较

六、讨论

CPIV是引起犬上呼吸道感染和脑脊髓炎的主要病原，在自然条件下，CPIV常与支气管鲍特杆菌（BB）、2型腺病毒（CAV-Ⅱ）、犬瘟热病毒（CDV）、犬流感病毒（CIV）等混合感染，引起犬上呼吸道感染和嗅觉上皮损伤，对犬的健康和嗅探作业造成巨大障碍，但目前临床诊断中仍缺乏CPIV病毒与其他窝咳病病原的快速有效的鉴别方法。基于此因，本文利用LAMP技术建立了CPIV病毒的LAMP快速诊断方法，方法能在45min内判定结果，对窝咳病的其他病原无非特异性扩增，检测下限为0.62pg RNA，能够在水浴锅中完成扩增，通过目视就能判定结果。总体上具备了快速、特异、灵敏、不依赖贵重设备、适于临床检测的基本特点，在初步的临床应用中与RT-PCR相比展现出了更好的检测效果。本文建立了一种具备良好检测效果的CPIV病毒LAMP诊断方法，对犬窝咳病的防控具有重要意义，具有一定的推广应用价值。

（作者单位：公安部南京警犬研究所，210012）

（编辑：李冰）

（一）引物的设计与合成：根据GenBank中登录的CPIVNP基因序列，在NP基因保守区域设计5条LAMP引物（见表1），引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。