崔红标,范玉超,周 静,时 玉,徐 磊,郭学涛,胡友彪,高良敏(.安徽理工大学地球与环境学院,安徽 淮南 300；.中国科学院南京土壤研究所,江苏 南京 0008)



改良剂对土壤铜镉有效性和微生物群落结构的影响

崔红标1,2,范玉超1,周 静2*,时 玉2,徐 磊2,郭学涛1,胡友彪1,高良敏1(1.安徽理工大学地球与环境学院,安徽 淮南 232001；2.中国科学院南京土壤研究所,江苏 南京 210008)

摘要：以一次性添加木炭、石灰和磷灰石稳定化修复4年后的土壤为研究对象,探讨了土壤中铜镉有效性和土壤微生物群落结构的变化.结果表明,3种改良剂的添加提高了土壤pH值,降低了土壤交换性酸和交换性铝的含量,使铜镉由活性态向非活性态和潜在活性态转化,其中磷灰石和石灰的处理效果优于木炭处理; Biolog测试发现,培养192h,木炭、石灰和磷灰石处理土壤AWCD值(0.61、0.76和0.70)分别是对照的1.33、1.65和1.52倍;且Shannon和McIntosh指数均较对照有所提高,表现为:石灰>磷灰石>木炭,表明改良剂处理后增加了土壤微生物对碳源的利用能力,提高了其功能多样性.PCR-DGGE分析结果显示,改良剂处理后土壤细菌优势群的数量显著增加,木炭、石灰和磷灰石处理Shannon指数分别比对照提高了0.22、0.39和0.24.相关性分析表明,土壤酸度和重金属有效性是影响稳定化修复重金属污染土壤细菌结构多样性差异的主要因素.

关键词：重金属；有效性；Biolog；PCR-DGGE；微生物群落结构

* 责任作者, 研究员, zhoujing@issas.ac.cn

随着我国现代工农业的迅猛发展,有毒化学污染物尤其是重金属通过多种途径进入到农业生态环境中,造成土壤重金属污染,并对人体健康构成严重威胁.因此,对重金属污染土壤进行修复已成为当前国内外研究的热点.稳定化是指通过向土壤中添加改良材料使重金属向低溶解、被固定、低毒形态转化,达到降低污染土壤重金属有效性和环境风险的方法[1].因为具有操作简便、低成本优势,稳定化方法已成为当前治理重金属污染土壤最有效的途径之一.研究表明,磷酸盐、石灰性物质和有机物等在降低土壤重金属活性,减少污染物向其他介质迁移风险方面具有较好的效果[2-4].近年来,我国的科研工作者在广西环江、江西省贵溪市冶炼厂周边区域、湖南湘江流域等[5-8]开展了不同规模的重金属污染农田修复,取得了较好的稳定化效果.但这些工作主要关注土壤重金属活性的变化及其在食物链的迁移,极少有对长期原位稳定化修复多年后土壤微生物的响应进行研究.

重金属污染土壤的修复不仅仅在于土壤重金属总量及有效性的降低,土壤生物多样性的恢复也是一个重要的方面[9-10].微生物是土壤最活跃的组成,大量研究表明,土壤微生物对重金属污染物的响应十分敏感[11-13].因为重金属在土壤微生物的生命过程中扮演重要的角色,如Co、Cu、Mn、Zn和Ni等是微生物生长的必需元素,它们在微生物生化反应中起到催化作用,对蛋白质结构和细胞壁具有保护功能,并参与一些氧化还原过程[14].另外,当土壤中存在较高浓度的重金属时,对土壤微生物会产生显著的效应:一是不适应新环境的微生物数量的减少或绝灭;二是适应新环境的微生物数量的增加和积累[15].因此,土壤长期遭受重金属污染后,土壤微生物的群落结构、微生物数量、土壤酶活性可能发生显著的变化.如李小林等[16]研究表明四川省汉源县福泉乡万顺铅锌矿区尾矿区(DTPA提取态Zn、Pb和Cd含量分别为790、883和8mg/kg)比对照(DTPA提取态Zn、Pb和Cd含量分别为16、8和1mg/kg)中细菌、真菌和放线菌数量分别降低了98.6%、92.2%和99.0%.

基于此,本文对江西省贵溪冶炼厂周边重金属污染土壤,采用一次性添加木炭、石灰和磷灰石联合植物提取的修复方法,对修复4年后土壤铜镉有效性和微生物群落多样性进行分析,研究结果可为重金属污染土壤长期稳定化修复微生物多样性的变化提供基础资料.

1 材料与方法

1.1 区域概况

研究区域位于江西省贵溪市,属于亚热带季风型气候,温暖湿润,年平均降水量为1808mm.由于农民使用企业排放含有重金属的污水进行灌溉,导致周边130多hm2农田遭受重金属污染(主要污染物是Cu和Cd)并导致水稻减产及稻米Cd含量超标[17-18].目前,大部分区域处于抛荒状态,且在周边严重污染区域,寸草不生,并出现沙化现象[18].

1.2 实验设计

根据梁家妮[19]的研究结果,选择木炭、石灰和磷灰石3种材料为改良剂.其中木炭(粒径0.80mm,比表面积1155m2/g,购自上海海诺炭业有限公司)、石灰(粒径0.16mm,购自江西鹰潭建材大市场)和磷灰石(粒径0.25mm,购自湖北南漳县鑫泰磷化工厂)的pH值分别为 9.96、12.2和8.40,石灰和磷灰石的Cu含量分别为:1.36、9.54mg/kg;Cd含量分别为:0.87、1.18mg/kg.

2009年11月,采用随机区组设计,每个处理重复3次,4个处理分别为:(1)对照(不加任何改良剂);(2)1%(w/w,土壤0～17cm表层质量百分比)磷灰石处理(22.3t/hm2);(3)0.2%(W/W)石灰处理(4.45t/hm2);(4)3%(W/W)木炭处理(66.9t/hm2).采用人工翻耕、耙匀,反复2次,使改良剂与0～17cm表层土壤充分混匀.每个小区长3m,宽2m.各小区间田埂采用防渗聚乙烯塑料薄膜(30cm高)包裹,防止因雨水径流影响实验结果.

1.3 样品采集

在2013年6月收获小区中生长的土著植物金黄狗尾草(木炭、石灰和磷灰石处理每小区植物干生物量均值分别为538、1210和2759g)后使用铁铲在每个小区采集表层0～17cm土壤(剥离靠近铁铲内壁的土壤),并将部分样品装于无菌自封袋中,分两部分用冰块冷却保存,其中一份带回实验室后置于-40℃冰箱,用于提取土壤DNA分析;另一份保存在0～4℃冰箱,用于土壤微生物群落功能多样性和理化性质的测定.

1.4 测定方法

1.4.1 土壤重金属化学形态分析 土壤重金属化学形态分级程序建立在Tessier方法[20]的基础之上,具体实验操作参照Cui等[18]的方法.

1.4.2 土壤微生物群落功能多样性测定 土壤微生物量碳氮含量采用氯仿熏蒸-浸提方法测定

[21].称取过10目筛的新鲜土穰15g于玻璃培养皿中,将培养皿置于装有50mL无乙醇氯仿的小烧杯及一个装有蒸馏水的小烧杯的干燥器内.然后,用真空泵抽至氯仿沸腾并保持2min,将干燥器放入25℃的恒温室或恒温箱中熏蒸24h.待氯仿去除干净后,称取10g熏蒸后土壤于80mL带内盖的塑料瓶中,加25mL 0.5mol/L的K2SO4溶液,在往复式震荡机上振荡提取30min,过滤.滤液保存在4℃冰箱中备用.同时做不熏蒸样品的提取.所得滤液用TOC仪测定微生物生物量碳、氮:

微生物碳=(熏蒸碳-未熏蒸碳)×2.64

微生物氮=(熏蒸氮-未熏蒸氮)×1.85

土壤微生物群落功能多样性的测定采用Biolog平板分析法[22].称取10g过2mm筛的新鲜土壤置于装有100mL 0.5mol/L磷酸缓冲液灭菌的250mL三角瓶中,振荡20min;静置25min后,在超净台上用灭菌的0.5mol/L磷酸缓冲液将上述溶液稀释到10-3倍;然后,用8通道的加样器向Biolog GN 96孔板中分别添加 150µL稀释后的悬液.28℃培养9d,每隔24h用Biolog自动读数装置在590nm下测定其吸光值.

1.4.3 土壤DNA提取和PCR-DGGE测定 土壤总DNA用FastDNAR SPIN Kit for soil (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)试剂盒提取.每个土壤样品准确称取0.5g土壤,按照试剂盒提取步骤提取土壤总DNA.提取后的土壤总DNA溶解在70µL TE缓冲液中,用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.USA)分光光度计测定总DNA的浓度.由于土壤有机质含量较高,提取的总DNA颜色较深,会影响PCR扩增,因此采用Mobio DNA纯化试剂盒对提取的总DNA进行纯化,接着用50µL TE缓冲液溶解纯化后总DNA;最后使用分光光度计测定纯化后总DNA的浓度,并于-20℃保存.

PCR扩增:以纯化后的土壤DNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板,在Hybaid Omni Gene Temperature Cycler热循环仪(Hybaid, Teddington, United Kingdom)上PCR扩增.扩增引物为(细菌通用引物):GC-341F/9 07R,片段长度大约560bp,分别为:341F(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’), GC-clamp(341F)(5’-CCCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGCCG-3’),907R (5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’).

扩增反应体系(25µL):11.5µL ddH2O, 12.5µL Premix Tap DNA聚合酶,0.5µL DNA模板,0.25µL正向引物(20ng/µL),0.25µL反向引物(20ng/µL).

扩增反应条件:94℃预变性5min,(94℃/35s, 56℃/30s,72℃/45s)×30个循环,72℃延伸10min, PCR 反应的产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测.

DGGE分析:采用Bio-Rad公司Dcode TM的基因突变检测系统对PCR反应产物进行分析.主要参数为:变性剂浓度梯度为45%～70%(变性剂为尿素和去离子甲酰胺),6%的聚丙烯酰胺凝胶,点样量为10µL PCR产物,温度为60℃,电压75V,电泳时间为15h.电泳完毕后,在 SYBR Green中染色30min,然后用Bio-Rad凝胶成像系统的Quantity One 4.4.0软件分析染色后的凝胶,观察样品的电泳条带数量并拍照.

1.5 数据处理

相关分析(Pearson相关)、T-检验、主成分分析等都在SPSS 19上实现.使用Quantity One软件对DGGE图谱进行解析,并进行聚类分析.

2 结果与讨论

2.1 土壤性质与重金属形态的变化

如表1所示,木炭、石灰和磷灰石处理4年后土壤pH值比对照提高0.37、0.70和1.04个单位.对于交换性酸来说,木炭、石灰和磷灰石处理比对照显著降低了1.26、1.90和2.78cmol/kg.与交换性酸相似,木炭、石灰和磷灰石处理交换性铝分别比对照降低了1.17、1.84和2.50cmol/kg.另外,木炭、石灰和磷灰石处理4年后土壤交换性钙含量分别较对照显著提高了1.54、1.98和2.44cmol/kg.修复4年后,改良剂的修复对土壤微生物量碳影响显著大于土壤微生物量氮,其中木炭、石灰和磷灰石处理中微生物量碳的含量分别比对照提高了6.0、35.9和20.6mg/kg,增幅分别为10.8%、64.3%和36.9%;微生物量氮的含量分别比对照提高了0.06、1.37和0.96mg/kg,增幅分别为1.08%、24.7%和17.3%.

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表1 修复4年后土壤主要化学性质变化Table 1 Changes of soil chemical characteristics after four-year immobilization

如表2所示,对照处理Cu主要聚集于残渣态(227mg/kg),且5种形态Cu的分布规律为:RES(残渣态)> EXC(离子交换态)> Fe-Mn(铁锰氧化物结合态)> OM(有机结合态)> CA(碳酸盐结合态).改良剂修复四年后,最显著的变化是木炭、石灰和磷灰石处理离子交换态Cu含量较对照分别降低了25、39和86mg/kg,铁锰氧化物结合态Cu含量分别增加了60、64和103mg/kg.对于有机结合态和残渣态,各处理间未有显著性差异.与Cu相似,改良剂的应用均降低了离子交换态Cd的含量,增加了铁锰氧化物结合态Cd的含量.另外,改良剂的应用不同程度地提高了残渣态Cd的含量.

总体上,木炭、石灰和磷灰石添加后,显著提高了土壤pH值,土壤Cu和Cd由活性态逐渐转变为非活性态,降低了土壤中Cu和Cd的有效活性,且磷灰石和石灰的稳定化效果好于木炭处理.土壤重金属活性的降低可能是由于改良剂显著提高了土壤pH值,这有助于提高粘土矿物、有机质和铁锰氧化物等变价胶体的负电荷,增加土壤对重金属的吸附能力[23].另外,Bolan等[24]也发现石灰的添加促进了活性Cu向非活性和潜在活性形态转变.石灰对Cu和Cd的固定主要涉及形成碳酸盐或氢氧化物沉淀[25]以及离子交换等[24].对于磷灰石来说,其对Cu和Cd的固定主要通过表面络合、共沉淀、离子交换和固体的溶解作用等[26-28].如Shahid等[29]研究表明溶解性磷和固体性磷材料均能有效降低土壤中Pb和Cd的生物有效性.木炭对Cu和Cd的固定主要通过吸附、络合和离子交换等方式[30].同样,Uchimiya等[31]用肉鸡粪便制作的生物碳能有效降低水溶液中Cd、Pb和Ni的含量,并显著降低模拟酸雨下土壤中Pb的淋出.

表2 改良剂对土壤Cu和Cd化学形态的影响Table 2 Effects of amendments on fractions of soil Cu and Cd

2.2 改良剂对土壤微生物群落功能多样性的影响

利用Biolog测试系统研究重金属胁迫环境下,土壤微生物群落功能多样性已广泛应用[32-33].Biolog盘中每孔的平均吸光值(AWCD) 对土壤环境胁迫的反应比较敏感,可作为微生物整体活性的有效指标,反映微生物群落对碳源利用总的能力[34].Biolog生态测试板动态测定结果(图1)表明,在24h之前,各处理土壤微生物群落的AWCD值未表现出明显的变化;当培养到48h时开始出现变化,并在192h时发生明显变化,且各处理AWCD值大小表现为:石灰>磷灰石>木炭>对照.

根据图1各处理AWCD变化特点,选择培养192h时的AWCD值计算微生物群落功能多样性指数(表3).结果表明,与对照相比,木炭、石灰和磷灰石处理土壤AWCD值(0.61、0.76和0.70)分别是对照的1.33、1.65和1.52倍.这表明改良剂处理后增加了土壤中能利用有关单一碳源底物的微生物数量.作为当前研究土壤微生物群落多样性应用最为广泛的指数之一,Shannon指数是研究群落物种数及其个体数和分布均匀程度的综合指标,能用来表征群落物种丰富度[35].Simpson指数常用来反映群落中最常见物种的优势度,而McIntosh指数是群落内物种均一性的度量[36].

图1 土壤微生物在培养过程中平均吸光值(AWCD)变化Fig.1 Changes in average well color development (AWCD) of microbial during incubation

本研究中,改良剂处理均提高了Shannon和Simpson指数,但是均未与对照处理达到显著性差异,其中木炭、石灰和磷灰石处理Shannon指数分别比对照提高了0.08、0.23和0.14.与此相同,Humid等[32]研究表明,橄榄废物制作的生物碳添加到土壤中,能够提高重金属污染土壤微生物的Shannon指数.对于McIntosh指数,磷灰石和石灰处理与对照相比达到显著性差异,分别比对照提高了1.29和1.67.总体来看,改良剂的添加对Shannon和McIntosh指数影响较大,对Simpson指数影响较小,这表明磷灰石和石灰处理土壤增加了土壤微生物群落的丰富度和均匀度,但是对常见微生物群落优势度影响较小.同样, Fernández等[37]发现,改良剂的添加,增加了土壤微生物量和微生物群落结构多样性.这可能是由于改良剂的添加,不同程度地降低了土壤重金属的有效性,减少了对微生物的毒性;提高了土壤pH值和有机碳的含量,降低了土壤交换性酸、交换性铝,有利于微生物群落结构多样性的恢复[32].此外,3种材料的应用均能够有效降低土壤重金属活性,使得植物(金黄狗尾草)能够生长,而对照处理无任何植物生长.植被的建立(凋落物、根系分泌物等)有助于土壤微生物数量和功能多样性的恢复[38-39],这可能是导致改良剂处理后的土壤提高了微生物对碳源的利用能力主要原因.另外,木炭是一种有机改良剂,前人的研究表明其不仅能较好的吸附固定重金属,还可以作为微生物生长的良好载体[40].

表3 土壤AWCD值和微生物群落功能多样性指数Table 3 Soil microbial AWCD and microbial community diversity indeices

图2 不同改良剂处理土壤培养192h的主成分分析因子载荷Fig.2 Loadings of principal component analysis after 192h culturing of soils treated by different amendments

2.3 改良剂对土壤细菌结构多样性的影响

Biolog技术只能表征土壤中快速生长或富营养的微生物活性,但是可培养的微生物种类仅占土壤微生物种类总数的0.1%～1%[42],无法反映土壤中缓慢生长以及不可培养的微生物活性[43].PCR-DGGE技术是基于核酸序列的不同,将片段大小相同的DNA序列分开的一种技术方法[44].该技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优势,且已经在环境微生物研究中得到较多的应用[45-46].本研究提取了土壤DNA,并进行了纯化,然后16SrDNA基因V3区PCR扩增,最后进行DGGE变性梯度凝胶电泳)分析.

不同改良剂处理后土壤细菌DGGE分析结果如图3所示.从电泳条带数目来看,与对照相比,改良剂处理后的土壤显著增加了电泳条带数,如图中标示的条带2、5和6.另外,在对照处理中出现的较高亮度的条带1均未在改良后的土壤中出现.由于条带的数目反映了细菌优势群的数量[47],因此,本研究中改良剂处理后的土壤总体上增加了土壤中细菌优势群的数量,表明为了适应新的土壤环境的变化(重金属活性及土壤性质等),细菌群落也随之发生变化[48].另外,从条带的亮度来看,在磷灰石、石灰和木炭处理中条带3的亮度明显低于在对照中的亮度,而条带4的亮度均高于对照处理.本研究发现所有处理中出现了一些共有的条带,这表明供试土壤中可能存在一些共有的细菌优势群;而且这些共有条带的强度也不相同,如在磷灰石和石灰处理中,条带7和条带8的亮度明显强于对照处理,这表明磷灰石和石灰处理土壤增加了该细菌优势群的数量.与此类似,Kan等[49]发现磷灰石和甲壳素改良重金属污染土壤与对照相比,更有利于土壤细菌优势群和群落多样性的增加.

图3 不同处理土壤微生物16S rDNA片段的DGGE图谱Fig.3 DGGE patterns of 16S rDNA fragments in soils treated by different amendments

同时,根据Quantity One得到通过DGGE的条带配对图,在条带出现的地方定义1,未出现的地方记为0,得到DGGE条带配对的二次矩阵,利用PAST计算各处理的Shannon(H)指数来分析各处理土壤细菌结构多样性(未列出).结果表明,木炭、石灰和磷灰石处理分别使Shannon(H)指数从对照的2.27提高到2.49、2.66和2.51,分别比对照提高了0.22、0.39和0.24,表明改良剂处理后提高了土壤细菌结构多样性,且石灰处理的土壤细菌结构多样性最高.为了进一步揭示供试土壤中细菌群落的同源性,采用非加权成对算术平均法(UPGMA)对土样DGGE指纹图谱作相似性聚类分析.由图4可知,所有供试土壤的遗传相似性为45%,在84%的相似性水平上可以将4个处理土壤区分开来.可见,不同改良剂处理土壤细菌群落结构存在一定差异.通过将土壤微生物群落结构多样性Shannon(H)指数与土壤化学性质进行相关分析发现(数据未列出),Shannon(H)指数与土壤pH值呈极显著正相关关系,相关系数为0.72(P<0.01),与土壤交换性酸、交换性铝呈显著的负相关关系.因为土壤pH值可用来表示土壤活性酸度,是土壤溶液中H+浓度的直接反映;交换性酸、交换性铝可用来表达土壤潜性酸度,是土壤胶体吸附的可代换性H+和Al3+.可见,土壤酸度是影响土壤细菌结构多样性的主要因素.另外,Shannon(H)指数与离子交换态Cu和Cd呈负相关关系,说明重金属有效性的降低,有利于土壤细菌结构多样性的增加.

图4 不同改良剂处理DGGE图谱聚类分析Fig.4 Cluster analysis of DGGE profile for bacterial communities treated by different amendments

3 结论

3.1 木炭、石灰和磷灰石的添加,提高了土壤pH 值,降低了土壤交换性酸及交换性铝含量,使Cu和Cd由活性态向潜在活性态和非活性态转化,降低了土壤重金属的有效性.

3.2 改良剂处理后的土壤微生物群落平均吸光值(AWCD)以及Shannon和McIntosh指数均较对照有所提高,表现为:石灰>磷灰石>木炭>对照,表明改良剂处理后提高了土壤微生物利用碳源的能力,增加了土壤中能利用有关单一碳源底物的微生物数量.

3.3 改良剂处理后的土壤总体上增加了土壤细菌优势群的数量,并增加了土壤细菌结构多样性,相关性分析表明,土壤酸度和重金属有效性是影响稳定化修复重金属污染土壤细菌结构多样性差异的主要因素.

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Availability of soil Cu and Cd and microbial community structure as affected by applications of amendments.

CUI Hong-biao1,2, FAN Yu-chao1, ZHOU Jing2*, SHI Yu2, XU Lei2, GUO Xue-tao1, HU You-biao1, GAO Liang-min1(1.School of Earth and Environment, Anhui University of Science and Technology, Huainan 232001, China；2.Institute of Soil Science, Chinese Academy Sciences, Nanjing 210008, China).China Environment Science, 2016,36(1)：197～205

Abstract：Concentrations of available Cu and Cd, soil microbial community structure were investigated with one-time application of charcoal, lime, and apatite after four years in a heavy metal contaminated soil.Results showed that incorporation of amendments significantly increased soil pH, and decreased the concentrations of exchangeable acidity and aluminum.Lime and apatite were more effective than charcoal on transforming Cu and Cd from active to inactive fractions.The Biolog analysis showed that AWCD (average well color development) of charcoal (0.61), lime (0.76), and apatite (0.70) were 1.33, 1.65 and 1.52 times higher than that in the untreated soil at 192h.Moreover, the Shannon index, McIntosh index of soil microbes were higher in the amended soils compared with the control, and followed the order of lime > apatite > charcoal.The results indicated amendments treated soils all increased the abilities of the microbes to use carbon sources.Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) analysis showed that the amounts of dominant bacterial were significantly increased with the application of amendments.The Shannon index of soil microbes were increased 0.22, 0.39 and 0.24 in charcoal, lime and apatite compared with the control, respectively.Correlation analysis indicated that soil acidity and availability of Cu and Cd may be the main factors affecting the community structure of soil microbes in the soils.

Key words：heavy metal；availability；biolog；PCR-DGGE；microbial community structure

中图分类号：X53

文献标识码：A

文章编号：1000-6923(2016)01-0197-09

收稿日期：2015-05-25

基金项目：国家"973"项目(2013CB934302);安徽理工大学博士、硕士基金(11276);中国科学院“STS”项目(KFJ-EW-STS-016);国家科技支撑计划课题(2015BAD05B01)

作者简介：崔红标(1985-),男,安徽凤台人,讲师,博士,主要从事土壤重金属污染修复研究.发表论文8篇.