冯欢欢 张一凡 任雪 徐彩红

摘要：建立一种维生素D3（VD3）在大鼠体内浓度的测定方法，为食品中营养素的生物利用研究奠定基础。采用RP-HPLC法进行检测分析；采用甲醇沉淀蛋白结合乙醚液液萃取法进行血浆样品处理。结果表明：低、中、高3个浓度VD3的提取回收率分别为87.8%±5.14%，85.4%±3.00%和89.6%±5.71%；日内、日间的精密度分别小于5.12%和6.30%。该方法灵敏度高、稳定性好，可作为食品、药学研究中大鼠体内吸收动力学相关试验研究的检测分析方法。

关键词：高效液相色谱法；25-羟基维生素D3；大鼠血浆

中图分类号：R446.1 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）02-0047-03

维生素D（Vitamin D，VD）是一种脂溶性维生素，见光极易分解，其作用主要是调节人体内钙和磷的代谢，促进其吸收利用，促进骨骼成长[1-2]。VD的主要活性形式有25-羟基维生素D3[25（OH）VD3]，1，25-二羟基维生素D3 [1，25（OH）2VD3]和24，25-二羟基维生素D3[24，25（OH）2VD3]3种。其中25（OH）VD3为血液中VD的主要循环形式，是显示VD状况的一个最佳指标[3]，但其在血清中浓度相当低，一般检测方法无法检出[4-5]。为此，本课题参考相关文献，建立一种利用高效液相色谱法检测维生素D3（VD3）的方法。

1 材料与方法

1.1 试剂

维生素D3（VD3，纯度99.9%）：中国食品药品检定研究院；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）：上海永日药品贸易有限公司；甲醇（色谱纯）：山东禹王化工制品有限公司；无水乙醚（分析纯）：天津凯信化工制品有限公司；其他试剂均为分析纯；水为自制二蒸水。

1.2 供试动物

雄性Wistar大鼠，体质量220±30 g，由沈阳药科大学实验动物中心提供。

1.3 仪器设备

1200系列高效液相色谱仪，包括1200泵系统和可调波长紫外检测器和工作站：美国Agilent公司；Avanti J-E离心机：BECKMAN COULTER公司。

1.4 试验方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱：ODS HYPERSIL C18色谱柱（200.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇—水（98∶2，V/V）；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：265 nm；进样量：20 μL；仪器灵敏度：0.001 AUFS。

1.4.2 血浆样品处理 精密量取大鼠血浆100 μL，置10 mL具塞离心试管中，加入甲醇200 μL，涡旋混合1 min，加入无水乙醚2.0 mL，涡旋3 min，6 000 r/min离心5 min，吸取有机层1.5 mL置另一5 mL试管中，残液中再加入无水乙醚2.0 mL。重复上述提取过程，合并两次提取液，于40 ℃水浴中氮气吹干。残留物用100 μL流动相溶解，涡旋振荡3 min，将溶液转移至1.5 mL EP离心试管中，12 000 r/min离心10 min，取上清液20 μL进样，记录药物峰面积，并代入当天制备的标准曲线中，计算血浆中药物浓度。

2 结果与分析

2.1 色谱行为

在本试验所采用的色谱条件和血样处理方法下，大鼠空白血浆色谱图见图1中A；一定浓度的VD3溶液加入空白血浆中的色谱图见图1中B，VD3的保留时间为8.165 min；大鼠给药后某时间点的血浆样品色谱图见图1中C。结果表明：血浆中的内源性物质不干扰血浆中药物浓度测定。药物色谱峰的理论板数均不低于2 000，药物与杂质峰的分离度大于2.0。

2.2 标准曲线、线性关系与最低定量浓度

在大鼠空白血浆中分别添加适量VD3使血药浓度相当于0.15，0.40，0.60，1.00，2.00和5.00 μg/mL，按血浆样品处理方法操作，将所得数据回归得标准曲线方程：y=42.11 x-7.73，R=0.999 0。最低定量浓度为0.125 μg/mL（RSD=7.81%，n=3）。

2.3 精密度

配制低、中、高3个浓度的VD3大鼠血浆样品溶液（0.40，1.00，2.00 μg/mL），每一浓度进行6个样本分析，考察日内和日间精密度（见表1）。结果表明：日内、日间精密度（RSD）均小于15%，准确度（RE）在±10%范围内，均符合生物样品分析测定的要求。

2.4 提取回收率

配制低、中、高3个浓度的质控样品，按血浆样品处理方法操作，每一浓度进行6个样本分析，评价该方法的提取回收率（见表2）。结果表明：大鼠血浆中VD3低、中、高3个浓度下的提取回收率均高于80%。

2.5 冻融稳定性

取空白大鼠血浆100 μL，分别配制低、中、高3个浓度的QC样品，每一浓度进行3个样本分析，反复冻融3次，每次复融后，按血浆样品处理方法操作，残留物以100 μL流动相溶解，进样分析（见表3）。结果表明：100 μL血浆样品中VD3反复冻融3次后稳定。

3 结论与讨论

维生素D是人体生长发育过程中不可缺少的营养物质之一，在维持机体代谢和预防疾病方面也发挥着重要作用。传统的检测方法是采用竞争结合试验和免疫测定法来检测循环中总的维生素D（D2和D3），而本试验选择25（OH）VD3最强吸收波长265 nm处HPLC检测，采用沉淀蛋白结合乙醚液液萃取的血浆样品处理方法，避免了血浆内源性杂质的干扰，该方法灵敏度高、稳定性好。

VD3在光照条件下不稳定，会有一定程度的降解，因此，本试验操作全程避光。血浆样品的处理中，提取剂的选择尤为重要，不少研究曾用过不同比例的正己烷与二氯甲烷或正己烷与乙醚的混合溶剂提取[6-9]，但是本试验发现：以二氯甲烷和正己烷（4∶1，V/V）作为提取剂，样品浓缩吹干耗费时间较长，色谱峰中杂质较多；若以纯正己烷提取，VD3的提取率较低。经过多次尝试，最终选用甲醇沉淀蛋白，而后采用无水乙醚液液萃取法来提取VD3，结果表明：VD3的提取率稳定在85%以上，色谱图显示血浆中内源性物质不干扰测定。该检测方法简单、灵敏、稳定、可靠，适用于大量样本的分析，尤其适用于食物或药品中VD3在大鼠体内的药物动力学研究。

参考文献

[1] 周剑锁，张捷.维生素D临床应用研究进展[J].检验医学，2013，28（6）：539-543.

[2] 唐佳运，乔逸. 维生素D与免疫调节和人类疾病关系研究进展[J].中国免疫学杂志，2014（12）：1 721-1 725.

[3] 李水军，王思合，周建烈，等.维生素D代谢及25-羟基维生素D测定方法研究进展[J].国际检验医学杂志，2012，33（24）：

3 028-3 030.

[4] 徐军，张慧芬，邵裕冲，等.高效液相色谱法测定人血中脂溶性维生素的含量[J].中国药学杂志，2006，41（2）：147-149.

[5] 王剑，朱玮琪，沈立松.高效液相色谱法测定血清中25-羟基维生素D3[J].检验医学，2008，23（4）：380-383.

[6] 龙恩武，卿钦，杨艳.HPLC测定人血清中的25-羟维生素D3[J].华西药学杂志，2010，25（2）：181-182.

[7] 曾义.高效液相色谱—质谱法检测血清中维生素D含量[J].中国药业，2013，22（20）：17-18.

[8] 吴景，邢书霞，曹进.食品中维生素检测技术研究进展[J].食品安全质量检测学报，2015（8）：2 881-2 889.

[9] 黄芳，吴惠勤，杭义萍.高效液相色谱—串联质谱法测定食品中维生素D2和维生素D3[J].理化检验（化学分册），2011，47（5）：577-582.