刘彦礼， 乔 梁， 张金珠， 杨 芬， 闫 岩， 闫 欣△， 林俊堂△

(1新乡医学院生命科学技术学院, 2河南省医用组织再生重点实验室， 河南 新乡 453003)

C1型尼曼-匹克氏症小鼠的肾脏功能及病理变化*

刘彦礼1, 2， 乔 梁1, 2， 张金珠1， 杨 芬1， 闫 岩2， 闫 欣1△， 林俊堂1, 2△

(1新乡医学院生命科学技术学院,2河南省医用组织再生重点实验室， 河南 新乡 453003)

目的： 探讨Npc1基因突变小鼠肾脏功能及病理生理的变化，为C1型尼曼-匹克氏症(NPC1)患者临床上药物的使用及肾功能的维持提供理论依据。方法: 用PCR法确定小鼠基因型；选取出生后第60天(P60)的野生型NCPC1(Npc1+/+)和突变型NCPC1(Npc1-/-)小鼠，检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性及尿素(Urea)、尿酸(UA)和肌酐(Cr)的含量来评价Npc1-/-小鼠的肝肾功能变化；进一步常规冷冻切片后通过β-半乳糖苷酶染色及Masson染色来分别评价Npc1-/-小鼠肾脏衰老及纤维化情况。结果: 与P60的Npc1+/+小鼠相比，Npc1-/-小鼠的体重和肾脏重量显著降低(P<0.01)；肝肾功能明显减退：ALT、AST及LDH活性显著升高(P<0.05)，Urea、UA及Cr的含量显著增加(P<0.05)；冷冻切片染色结果表明肾脏组织衰老明显(P<0.01)，纤维化程度显著增强(P<0.01)。结论:Npc1基因突变导致的脂质异常代谢可加速肾间质纤维化，促使肾脏衰老，最终导致肾功能减退。

C1型尼曼-匹克氏症； 肾脏； 纤维化；Npc1基因

作为一种罕见的致死性常染色体隐性遗传疾病，C1型尼曼-匹克氏症(Niemann-Pick disease type C1，NPC1)是由Npc1基因突变引起的神经系统及机体内脏脂类代谢异常疾病[1-2]。该病多发于幼儿，少数在中青年发病，新生儿患病率约为1/120 000，患者多在发病后的5～20年内死亡。NPC1患者临床初期表现为肝脾肿大，后期主要表现为进行性神经系统受损，如共济失调、肌张力障碍、痴呆和癫痫等，其主要原因是Npc1蛋白结构发生变化，导致细胞内脂类运输障碍，引起细胞内脂质体中未酯化的胆固醇、鞘糖脂等沉积，进而促使细胞变性死亡[3-5]。目前，国内外尚缺乏有效的治疗手段，主要以对症治疗、预防和支持治疗为主，最大限度延长患者寿命，改善患者生活质量。

前期研究已表明Npc1基因自发突变所产生的Npc1-/-小鼠(BALB/cNctr-Npc1m1N/J)临床表型及相关病理学变化与人类NPC1神经病变相似，是研究NPC1的理想动物模型[6]。目前，NPC1的研究多集中于神经系统病变，而对机体其它脏器病理变化研究较少[2-3, 5]。因此，本实验将以Npc1-/-小鼠为对象，研究其晚期肾脏的病理变化，探讨Npc1基因突变对肾脏影响的潜在机制，进一步为临床上改善患者生活质量和延长寿命提供支持。

材 料 和 方 法

1 实验动物

Npc1+/-小鼠由浙江大学段树民院士提供；6～8周SPF级BABL/c小鼠，体重(24±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号SCXK(京)2012-0001]。所有实验动物饲养于室温(22±1)℃，湿度控制在40%～70%，12 h/12 h明暗交替。饲料、垫料和饮水均经过高温高压灭菌处理后使用；实行自由采食和饮水，垫料1周更换2次。

2 主要试剂

鼠尾基因组DNA提取试剂盒及PCR相关试剂(康为世纪生物科技有限公司)；β-半乳糖苷酶染色试剂盒及封片液(碧云天生物技术有限公司)；Masson染色试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

3 主要方法

3.1Npc1-/-小鼠的获得及鉴定 2月龄雌性BABL/c小鼠与雄性杂合子(Npc1+/-)小鼠按照2∶1配对合笼，交配后获得野生型(+/+)、杂合型(+/-)和突变型(-/-)子鼠。子鼠于3周左右断奶，根据性别分笼。基因型鉴定程序如下：鼠尾基因组DNA提取后，分别采用图1A所示引物对Npc1+/+和Npc1-/-小鼠进行基因型鉴定，具体PCR反应条件为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,63 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 2 min。PCR扩增产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。判断标准为：野生型(Npc1+/+)173 bp；杂合型(Npc1+/-)173 bp和475 bp；突变型(Npc1-/-)475 bp。

3.2 血清中肝肾功能相关指标的检测 取出生后第60天(postnatal day 60，P60)的Npc1-/-和Npc1+/+小鼠各5只，称重后采用摘眼球法收集血液约0.6 mL于促凝管中，立即送至新乡医学院第三方医学检验中心进行相关指标检测。其中血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性通过速率法检测；血清中尿素(urea)、尿酸(uric acid，UA)及肌酐(creatinine，Cr)含量分别通过脱氢酶法、尿素酶法及氧化酶法进行测定。

Figure 1.The results of mouse genotype identification. A: the primers used to identify different genotypes of NPC1 mice; B: PCR results of three genotypes for NPC1 mice after electrophoresis.Npc1+/+: wild type;Npc1+/-: heterozygote;Npc1-/-: mutant.

图1 野生型与突变型小鼠鉴定所需引物及结果

3.3 组织取材及切片 将上述采血后小鼠快速打开腹腔，摘取肾脏称重后转移至4 ℃预冷处理的PBS液漂洗3次，置于4%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)中，4 ℃摇床过夜；取出组织吸干液体，经15%和30%蔗糖溶液梯度过夜脱水，待组织沉淀到管底部时取出吸干液体；用锡箔纸做一直径为1 cm的柱状模型，加入适量OCT包埋剂，使肾脏竖立，确定肾脏位于柱状模型的正中央，置于液氮中冷冻后放-80 ℃冰箱保存；切片时取出已包埋的组织在冷冻切片机上固定，厚度20 μm切片后，于烤片机上37 ℃烤片30 min以上。

3.4 β-半乳糖苷酶染色 将冰冻切片于室温下固定30 min(β-半乳糖苷酶染色固定液)，PBS漂洗3次，每次5 min；弃去PBS后加入适量染色工作液(按试剂盒说明配制)，置于湿盒内37 ℃孵育过夜；封片后于体式显微镜及普通光学显微镜下观察；每种基因型(Npc1-/-和Npc1+/+)至少检测3只小鼠。随后，将原始图片转换成黑白图片，应用Motic Images Advanced 3.2软件进行灰度值扫描并量化。

3.5 Masson染色 将冰冻切片于室温下用4%PFA固定15 min，PBS漂洗3次；核染液染色60 s，冲洗液冲洗30 s；浆染液染色60 s，冲洗液冲洗30 s；分色液分色10 min后，复染液染色1 min；无水乙醇冲洗，封片后于体式显微镜及普通光学显微镜下观察，并对由胶原纤维沉积形成的斑块进行量化；每种基因型(Npc1-/-和Npc1+/+)至少检测3只小鼠。

4 统计学处理

所有检测数据以均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0软件完成统计，采用Student’st检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1Npc1-/-小鼠的鉴定

提取新生小鼠尾部DNA，利用野生型和突变型引物进行PCR扩增的结果如图1B所示。Npc1+/-小鼠可扩增出大小分别为475 bp和173 bp的2条目的条带；Npc1+/+小鼠仅能扩增出1条173 bp的条带；而Npc1-/-小鼠仅能扩增出1条475 bp的条带。

2 晚期Npc1-/-小鼠肾脏重量及肝肾功能的检测

Npc1-/-小鼠肾脏重量检测结果如图2所示，与Npc1+/+小鼠相比，Npc1-/-小鼠无论在体重及肾脏重量上均显著减少(P<0.01)。进一步通过检测血清中与肝脏及肾脏相关的关键酶活性及活性物质的含量变化来评价晚期Npc1-/-小鼠肝肾功能，结果如表1所示：与Npc1+/+小鼠相比，Npc1-/-小鼠血清中urea、Cr及UA含量均显著升高(P<0.05)，同时LDH、 ALT及AST的活性也有显著升高(P<0.05)。

Figure 2.The body weight and kidney weight ofNpc1+/+andNpc1-/-mice at P60. Mean±SD.n=22.**P<0.01vsNpc1+/+mice.

图2 P60Npc1+/+与Npc1-/-小鼠体重及肾脏重量比较

3 晚期Npc1-/-小鼠肾脏组织衰老的检测

Npc1+/+与Npc1-/-小鼠的β-半乳糖苷酶染色阳性(靛蓝色)细胞均定位在肾皮质，髓质中鲜有表达；与Npc1+/+小鼠相比，Npc1-/-小鼠肾脏的β-半乳糖苷酶染色阳性区域靛蓝色程度明显增加，且大部分肾小管出现弥漫性阳性染色；随后，将原始图片转换成黑白图片，灰度值扫描结果显示Npc1+/+与Npc1-/-小鼠的β-半乳糖苷酶染色阳性区域着色程度具有显著差异(P<0.01),见图3。

表1 肝肾功能相关指标的检测结果

Table 1.The activity of key enzymes and content of urea, UA and Cr in the serum ofNpc1+/+ andNpc1-/- mice at P60 (Mean±SD.n=5)

IndexesNpc1+/+Npc1-/-Urea(mmol/L)7.00±0.3011.53±1.31*Cr(μmol/L)11.33±0.5816.67±2.43*UA(μmol/L)102.00±20.81302.33±47.07**LDH(U/L)789.67±276.512014.33±560.42*ALT(U/L)37.33±9.54560.67±41.31**AST(U/L)128.67±27.54983.67±36.85**

Cr: creatinine; UA: uric acid; LDH: lactate dehydrogenase; ALT: alanine aminotranferase; AST: aspartate aminotranferase.*P<0.05,**P<0.01vsNpc1+/+mice.

Figure 3.Senescence-associated β-galactosidase staining in renal tissues ofNpc1+/+andNpc1-/-mice at P60. A: the images of β-galactosidase staining in renal tissues ofNpc1+/+andNpc1-/-mice under microscope; B: quantification of the color value in the transformed monochrome images. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNpc1-/-mice.

图3 P60Npc1+/+与Npc1-/-小鼠肾脏组织β-半乳糖苷酶衰老染色结果

4 晚期Npc1-/-小鼠肾脏组织纤维化的检测

Npc1-/-小鼠肾脏Masson染色纤维化部位(图中黑色箭头所指蓝色部位)主要定位于肾小管间质，可见大量胶原沉积，成条索状或小片状分布，着色深；而Npc1+/+小鼠肾脏Masson染色后未见明显胶原沉积形成；量化结果表明二者在由胶原沉积产生的斑块数量上具有显著性差异(P<0.01)，见图4。

Figure 4.Masson staining for renal fibrosis inNpc1+/+andNpc1-/-mice at P60 (the collagen plaques are indicated by black arrows). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNpc1-/-mice.

图4 P60Npc1+/+与Npc1-/-小鼠肾脏组织Masson染色结果

讨 论

NPC1作为一种典型的神经退行性疾病，是由Npc1基因突变所引起的，其所编码的蛋白是由1 278个氨基酸残基组成的细胞膜蛋白分子，可直接结合胆固醇后将其从脂质体转运到质膜和内质网，从而调节细胞内脂质代谢平衡[7-9]。该病多发于幼儿，少数在中青年发病，由于NPC病因的不可逆性，国内外目前尚缺乏有效的治疗手段，主要以预防性和支持性治疗为主，最大限度延长患者寿命，改善患者生活质量。

前期研究发现，NPC1患者神经组织中存在大量异常胆固醇、鞘磷脂及糖脂的沉积，其主要病理特征为神经轴突营养不良伴有球状轴突形成、神经元变性以及进行性脱髓鞘；进一步的研究表明，NPC1患者海马等脑区存在大量的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)，除异常磷酸化的tau蛋白外，还发现NFT或球状轴突内聚集了大量高度磷酸化的细胞骨架蛋白[10-12]。近年来，针对该疾病经典动物模型Npc1-/-小鼠的深入研究发现，该小鼠的丘脑-皮质系统在出生后3周左右即出现大量阿米巴样的小胶质细胞，其活性随着病情的发展逐渐增强，而大脑的不同部位超磷酸化神经细丝表达量也随着病情发展显著增加，产生大量的NFT，导致神经元变性或死亡，引起海马、丘脑、小脑和脊髓等多处神经组织发生病理性变化[13-15]。

目前，针对NPC1的研究多集中于神经及肝脾组织，对肾脏组织在疾病发展中的病理变化鲜有报道，仅明确在患者肾脏组织中存在典型的泡沫样细胞[1, 4]。而肾脏作为机体内容易受损、衰老的重要脏器，其功能运转情况深切影响患者生活质量及寿命。因此，本研究首先针对晚期(P60)Npc1-/-小鼠肾功能指标检测发现，与Npc1+/+小鼠相比，Npc1-/-小鼠肾脏重量不仅显著降低，而且功能减退明显。基于上述实验数据及已明确的Npc1基因突变会引起神经细胞过早凋亡等事实，我们推测Npc1基因突变亦会引起肾脏组织过早衰老，随后的β-半乳糖苷酶衰老染色结果也证实了Npc1-/-小鼠肾脏衰老程度要显著高于Npc1+/+小鼠；而进一步纤维化染色结果证明了Npc1-/-小鼠肾脏的衰老快速可能与其肾间质纤维化有关。

综上所述，本研究初步阐明了Npc1基因突变引起的脂质代谢异常可加速肾间质纤维化，促使肾脏衰老，最终导致患者肾功能减退。该结果可为NPC1患者临床上药物的使用及肾脏功能的维持提供借鉴，以期最大限度地改善患者生活质量及延长寿命。

[1] Vanier MT. Niemann-Pick disease type C[J]. Orphanet J Rare Dis, 2010, 5:16.

[2] 欧 翔，唐朝克. C 型尼曼-匹克蛋白 1 和 2 在细胞内脂质平衡中的作用[J]. 中国病理生理杂志, 2007, 23(4):820-824.

[3] Patterson MC, Hendriksz CJ, Walterfang M, et al. Re-commendations for the diagnosis and management of Niemann-Pick disease type C: an update[J]. Mol Genet Metab, 2012, 106(3):330-344.

[4] 汤 颖，刘 伟，刘俊平. C 型尼曼-皮克病的临床和病理学进展[J]. 中华病理学杂志, 2010, 39(5): 356-360.

[5] Mengel E, Klünemann HH, Lourenço CM, et al. Niemann-Pick disease type C symptomatology: an expert-based clinical description[J]. Orphanet J Rare Dis, 2013, 8:166.

[6] Loftus SK, Morris JA, Carstea ED, et al. Murine model of Niemann-Pick C disease: mutation in a cholesterol homeostasis gene[J]. Science, 1997, 277(5323): 232-235.

[7] Vanier MT. Complex lipid trafficking in Niemann-Pick disease type C[J]. J Inherit Metab Dis, 2015, 38(1): 187-199.

[8] Maulik M, Thinakaran G, Kar S. Alterations in gene expression in mutant amyloid precursor protein transgenic mice lacking Niemann-Pick type C1 protein[J]. PLoS One, 2013, 8(1):e54605.

[9] 李 慧, 杨志明, 肖传实, 等. 血管紧张素-(1-7)与血管紧张素Ⅱ对THP-1巨噬细胞NPC1表达及胆固醇流出的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2011, 27(3): 455-459.

[10]Kodam A, Maulik M, Peake K, et al. Altered levels and distribution of amyloid precursor protein and its processing enzymes in Niemann-Pick type C1-deficient mouse brains[J]. Glia, 2010, 58(11):1267-1281.

[11]Yan X, Yang F, Lukas J, et al. Hyperactive glial cells contribute to axonal pathologies in the spinal cord of Npc1 mutant mice[J]. Glia, 2014, 62(7): 1024-1040.

[12]Sarna JR, Larouche M, Marzban H, et al. Patterned Purkinje cell degeneration in mouse models of Niemann-Pick type C disease[J]. J Comp Neurol, 2003, 456(3): 279-291.

[13]Bi X, Liao G. Autophagic-lysosomal dysfunction and neurodegeneration in Niemann-Pick Type C mice: lipid starvation or indigestion?[J]. Autophagy, 2007, 3(6): 646-648.

[14]Bu B, Li J, Davies P, et al. Deregulation of cdk5, hyperphosphorylation, and cytoskeletal pathology in the Niemann-Pick type C murine model[J]. J Neurosci, 2002, 22(15): 6515-6525.

[15]Pressey SNR, Smith DA, Wong AMS, et al. Early glial activation, synaptic changes and axonal pathology in the thalamocortical system of Niemann-Pick type C1 mice[J]. Neurobiol Dis, 2012, 45(3):1086-1100.

(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

记忆提取过程中杏仁核积极和消极信息的不同路径

众所周知，基底外侧杏仁核(basolateral amygdala, BLA)在积极和消极记忆信息的形成中发挥着至关重要的作用，但我们对于其相关信息的编码和路径知之甚少。Beyeler等记录了在相关记忆提取过程中BLA神经元的变化，并使用光遗传学介导的光学示踪技术来鉴定连接BLA与伏隔核(nucleus accumbens, NAC)、中央杏仁核(central amygdala, CEA)或腹侧海马回(ventral hippocampus, vHPC)的神经元群的数量。研究发现，尽管每个群内都发生了不同的神经反应，但被奖励预测回路兴奋的BLA-NAc神经元和被厌恶预测回路兴奋的BLA-CeA神经元数量均多于整个BLA。虽然已知BLA-vHPC投射回路可驱动先天性消极行为，但这些神经元并不倾向于编码习得性消极行为。总之，这些研究结果表明，在BLA，两价信息的编码至少部分经由解剖学意义上的神经元群的不同活动所介导。

Neuron, 2016, 90(2):348-361(范冲竹)

Renal function and pathological changes in Niemann-Pick disease type C1 mice

LIU Yan-li1, 2, QIAO Liang1, 2, ZHANG Jin-zhu1, YANG Fen1, YAN Yan2, YAN Xin1, LIN Jun-tang1, 2

(1CollegeofLifeScienceandTechnology,XinxiangMedicalUniversity,2HenanKeyLaboratoryofMedicalTissueRegeneration,Xinxiang453003,China.E-mail:pangyufu@aliyun.com;linjtlin@126.com)

AIM: To investigate the renal function and pathological changes inNpc1 mutant (Npc1-/-) mice. METHODS: Different genotypes of Niemann-Pick disease type C1 (Npc1) mice were identified by PCR. Subsequently, the renal function ofNpc1-/-andNpc1+/+mice at postnatal day 60 (P60) was evaluated by measuring the activity and content of important indicators in the serum including ALT, AST, LDH, urea, UA and Cr. Furthermore, β-galactosidase staining and Masson staining were performed to examine the aging and fibrosis of the renal tissues, respectively. RESULTS: Compared with theNpc1+/+mice, the body weight and kidney weight had a significant reduction (P<0.01) in theNpc1-/-mice. The results of hepatic and renal functions showed that the activities of ALT, AST and LDH, and contents of urea, UA and Cr had marked increases (P<0.05) in theNpc1-/-mice. Moreover, the results of senescence-associated β-galactosidase staining in the renal tissues demonstrated accelerated aging in theNpc1-/-mice (P<0.01), and these results were confirmed by Masson staining, which clearly showed the formation of collagen fibers (P<0.01).CONCLUSION: Mutation of theNpc1 gene results in abnormal lipid metabolism, which accelerates kidney senescence by promoting fibrosis in the renal tissue and subsequently causes reduction in renal function.

Niemann-Pick disease type C1; Kidney; Fibrosis;Npc1 gene

1000- 4718(2016)08- 1435- 05

2015- 12- 31

2016- 03- 10

国家自然科学基金资助项目(No. 81400936)；国家自然科学基金-河南人才培养联合基金资助项目(No. U1304808)；河南省高等学校重点科研项目计划(No. 15A180009)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.016

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0373-3831679; E-mail: pangyufu@aliyun.com; linjtlin@126.com