于 宁， 杨 芳, 冷 雪， 张 妮， 王俊岩， 宋 囡△

(1辽宁中医药大学第一临床学院， 2辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室, 3辽宁省中医转化医学研究中心， 4辽宁中医药大学附属第二医院, 辽宁 沈阳 110847)

枸杞多糖通过调控PI3K/Akt/eNOS信号通路对去卵巢大鼠心肌产生抗氧化作用*

于 宁1， 杨 芳4, 冷 雪2,3， 张 妮2,3， 王俊岩2,3， 宋 囡2,3△

(1辽宁中医药大学第一临床学院，2辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室,3辽宁省中医转化医学研究中心，4辽宁中医药大学附属第二医院, 辽宁 沈阳 110847)

目的： 观察枸杞多糖对去卵巢大鼠心肌PI3K/Akt/eNOS信号通路的影响。方法: 将30只SD雌性大鼠随机分为假手术组、去卵巢组、补佳乐组、枸杞多糖高剂量组及枸杞多糖低剂量组，ELISA法比较各组血清雌激素、LDH及CK水平，检测心肌H2S含量及氧化应激损伤相关指标，HE染色观察各组心肌的形态变化，Western blot法检测各组大鼠心肌eNOS蛋白及PI3K/Akt通路蛋白的表达。结果: 与假手术组相比，去卵巢组大鼠血清雌二醇水平降低，心肌H2S含量和GSH-Px活性下降，心肌eNOS蛋白及PI3K/Akt通路蛋白的表达均有所降低，心肌ROS活性和MDA含量升高(P<0.05)，心肌细胞排列紊乱，细胞间隙增大，血清LDH和CK活性均增多；与去卵巢组比较，枸杞多糖高剂量组大鼠血清雌二醇含量增加(P<0.05)，心肌H2S含量、GSH-Px活性、eNOS蛋白及Akt磷酸化水平均提高，心肌ROS活性和MDA含量下降(P<0.05)，血清LDH和CK活性均降低，并且改善大鼠心肌形态的变化。结论: 枸杞多糖可以通过调控PI3K/Akt/eNOS通路改善去卵巢大鼠心脏变化防治绝经后心血管病变。

枸杞多糖； 去卵巢大鼠； 心血管疾病； PI3K/Akt/eNOS信号通路

女性绝经后心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)的患病风险极高，可达育龄期女性的3～4倍[1]。因此近半个世纪以来雌激素替代治疗(hormone replacement therapy，HRT)应用于围绝经期、绝经期及绝经后妇女。长期应用传统的HRT虽然可以改善绝经期综合征但却存在副作用，如诱发子宫内膜癌、乳腺癌等疾病的发生[2-4]，因此植物雌激素作为天然的雌激素替代品倍受关注。

近年来，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)对心脏的损伤作用越来越引起人们的重视。正常组织在氧化代谢中会产生少量的自由基，当一些损伤因素的起作用时，细胞内氧化代谢产物增加，造成ROS堆积，对细胞产生毒性，称为氧化应激[5]。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)作为植物雌激素可以通过抑制氧化应激对心脏起到保护的作用[6]，但其具体机制尚未完全阐明。研究发现PI3K/Akt信号通路在氧化应激引起的组织损伤中发挥了重要作用[7]。本课题通过研究枸杞多糖对PI3K/Akt信号通路的调控及对去卵巢大鼠心肌的抗氧化作用，探讨枸杞多糖防治绝经后心血管疾病的分子生物学机制，为中医中药在临床中的应用提供理论基础。

材 料 和 方 法

1 试剂及仪器

枸杞多糖(天然原料汇)；补佳乐(戊酸雌二醇片；Bayer)；大鼠雌二醇ELISA试剂盒及大鼠硫化氢(H2S)ELISA试剂盒(杭州联科)；大鼠乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)及肌酸激酶(creatine kinase，CK)ELISA试剂盒(IBL)；一氧化氮(nitric oxide，NO)、ROS、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒(南京建成)；抗PI3K、Akt和p-Akt抗体(CST)；抗内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗体(博奥森)；BCA蛋白测定试剂盒(北京鼎国昌盛)；凝胶制备试剂盒(武汉博士德)；三(羟甲基)氨基甲烷、甘氨酸和十二烷基硫酸钠(Genview)；TBS缓冲液(武汉博士德)。低速冷冻离心机和Multiskan FC型酶标仪(Thermo)；微型垂直电泳槽HE-180和转移电泳槽VE-1861(上海天能)。

2 实验动物、模型建立及分组给药

健康成年无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠30只，平均体质量(200±10)g，10～12 周龄，购于辽宁长生生物技术有限公司，于辽宁中医药大学实验动物中心饲养，自由饮食。在大鼠熟悉环境1周以后，开始每日2次随机抓取大鼠行阴道细胞学检查，共12 d(包括术前4 d和术后8 d)，根据阴道细胞形态判断大鼠动情周期存在状态[8]。

将上述雌性SD大鼠用10% 水合氯醛(0.3 mL/g)腹腔注射麻醉，俯位固定，在背部脊柱两侧切口，在无菌条件下摘除双侧卵巢(ovariectomized，OVX)。1周后将存活的大鼠随机分为5组，每组6只：假手术(sham)组(仅摘除双侧小块脂肪)、OVX组(单纯摘除双侧卵巢)、阳性对照戊酸雌二醇(estradiol valerate,Est)组(摘除双侧卵巢1周后，连续12周经口给予戊酸雌二醇0.105 mg·kg-1·d-1)、高剂量LBP(LBP-H)组和低剂量LBP(LBP-L)组(摘除双侧卵巢1周后，连续12周经口给予枸杞多糖，剂量分别为250和125 mg·kg-1·d-1)。Sham组和OVX组均经口给予等量生理盐水。

3 实验方法

3.1 血清雌二醇、NO、LDH及CK的检测 血清雌二醇、LDH及CK用ELISA法检测，具体操作参照各自说明书。NO按照试剂盒说明书，分别设计标准孔及对照孔，在酶标仪上450 nm处检测，将标准孔结果绘制标准曲线，将各组实验数据带入标准曲线算出结果。

3.2 心肌匀浆后检测H2S、ROS、MDA、GSH-Px及SOD水平 首先用生理盐水将心肌组织匀浆，制备为10%心肌匀浆液，然后按照大鼠H2S ELISA试剂盒说明书，分别设计标准孔及对照孔，将标准孔结果绘制标准曲线，将各组实验数据带入标准曲线算出结果，心肌组织ROS、MDA、GSH-Px及SOD的检测分别根据试剂盒说明书，分别设计标准孔及对照孔，在酶标仪上检测后计算结果。

3.3 心脏HE染色 取大鼠心脏组织， 4%多聚甲醛固定72 h，按苏木素-伊红(HE)染色常规方法进行， 70%～100%梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(切片厚度5 μm)、贴片、烤片后，用二甲苯脱蜡、70%～100%梯度乙醇复水、苏木精染色、70% 盐酸乙醇分色、伊红复染，再用 70%～100% 梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，石蜡包埋，光学显微镜下观察。

3.4 Western blot法检测PI3K、Akt、p-Akt和eNOS的蛋白水平 用蛋白裂解液提取各组心肌组织蛋白，利用BCA蛋白定量测定试剂盒对蛋白进行定量。以50 μg蛋白/泳道上样，经SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜，加入 I 抗，4 ℃封闭过夜，TBST洗涤10 min 3次，加入HRP标记的II抗。暗室中加发光液并进行曝光。X光片显影和定影后利用凝胶自动分析成像软件扫描分析结果，以β-actin为内参照，对蛋白条带进行相对定量分析。

4 统计学处理

计量数据采用SPSS 16.0软件处理，用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行分析，各组均数间两两比较采用Turkey检验，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠血清雌二醇、NO含量及心肌H2S含量的变化

与sham组比较，OVX组大鼠血清雌二醇和NO含量均减少(P<0.05)；与OVX组比较，LBP-H组雌二醇的含量显著增加，各治疗组大鼠血清NO含量存在升高的趋势，但差异无统计学显著性。与sham组比较，OVX组大鼠心肌组织H2S含量明显减少(P<0.01)；与OVX组比较，LBP-H组、LBP-L组及Est组H2S的含量均显著增加(P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠血清雌二醇、NO及心肌H2S含量的变化

Table 1.The serum levels of estradiol and NO, and the myocardial level of H2S in each group (Mean±SD.n=6)

GroupEstradiol(ng/L)NO(μmol/L)H2S(ng/L)Sham102.92±5.1512.48±1.9958.77±8.49OVX88.74±4.91*10.66±1.09**38.28±9.62**Est98.33±5.6810.24±0.5956.40±5.37▲▲LBP-H102.98±8.69▲10.65±1.0155.86±7.38▲▲LBP-L96.48±7.9910.41±0.7258.33±7.02▲▲

*P<0.05,**P<0.01vssham group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsOVX group.

2 各组大鼠心肌ROS、MDA、GSH-Px及SOD水平的变化

与sham组比较，OVX组大鼠心肌ROS和MDA含量均增多(P<0.01)；与OVX组比较，Est组及LBP-H组ROS和MDA含量显著降低。与sham组比较，OVX组大鼠心肌GSH-Px活性明显降低(P<0.01)；与OVX组比较，Est组及LBP-H组GSH-Px活性显著增高。另外，各组大鼠心肌组织SOD活性的差异并无统计学显著性，但其变化趋势与GSH-Px活性的变化一致，见图1。

Figure 1.The myocardial levels of ROS, MDA, GSH-Px and SOD in each group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsOVX group.

图1 各组大鼠心肌ROS、MDA、GSH-Px及SOD含量的比较

3 各组大鼠心肌形态的观察

镜下可见，各组大鼠心肌组织行HE染色后，与sham组相比，OVX组大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞间隙增大；Est组及LBP-H组的上述情况有改善，LBP-L组则对心肌形态的改变不显著，见图2。

Figure 2.Histopathological observation of the cardiac tissues (HE staining, ×200). A: sham group; B: OVX group; C: Est group; D: LBP-H group; E: LBP-L group.

图2 各组大鼠心肌形态的观察

4 各组大鼠血清LDH和CK活性的变化

与sham组比较，OVX组大鼠血清LDH和CK活性均升高(P<0.01)；与OVX组比较，Est、LBP-L和LBP-H组LDH和CK活性显著降低(P<0.01),见图3。

Figure 3.The activity of LDH and CK in each group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group;△△P<0.01vsOVX group.

图3 各组大鼠血清LDH和CK含量的比较

5 各组大鼠心肌组织eNOS蛋白的表达

与sham组比较，OVX组大鼠心肌组织的eNOS蛋白表达明显减低(P<0.01)；与OVX组比较，LBP-H组及Est组心肌组织eNOS蛋白的表达均显著提高(P<0.05)，见图4。

6 各组大鼠心肌组织PI3K/Akt通路蛋白的变化

与sham组比较，OVX组大鼠心肌组织PI3K蛋白的表达及Akt蛋白的磷酸化水平明显减低(P<0.01)；与OVX组比较，LBP-H组及Est组心肌组织PI3K蛋白的表达及Akt蛋白的磷酸化水平均显著提高(P<0.05)，见图5。

讨 论

近年来，雌激素是否对心脏有保护作用已逐渐成为研究者关注的焦点。研究表明，雌激素可通过影响脂类代谢、糖代谢、血管反应性、凝血和抑制动脉粥样硬化等途径减少心血管疾病的危险性，从而预防心肌缺血和心力衰竭[9]；雌激素也可直接作用于心肌，调节心肌细胞代谢，增强心肌功能[10]。即使在缺血、缺氧状态下雌激素也具有心肌保护作用，雌激素能降低心肌缺血诱发的心率失常，减少心肌坏死和梗塞面积[11]，促进再灌左心室功能的恢复[12]。

Figure 4.The protein expression of eNOS in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group;△P<0.05vsOVX group.

图4 各组大鼠心肌组织eNOS蛋白的表达

Figure 5.The protein levels of PI3K and p-Akt in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group;△P<0.05,△△P<0.01vsOVX group.

图5 各组大鼠心肌组织PI3K及p-Akt蛋白水平的比较

目前研究表明氧化应激在心肌梗死、心肌重塑、心力衰竭等过程中具有重要病因学意义[13]，在这些病理过程中，心肌细胞氧自由基产生不断增加，会引起细胞内蛋白质、脂质大分子、酶类及 DNA 的氧化损伤，导致能量代谢的变化，而致细胞凋亡和坏死[14]。女性进入绝经期后,其生理机能逐渐衰退,活性氧生成增加,伴随清除能力下降,氧自由基攻击生物膜,使膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化[15]。SOD和GSH-Px则是抗氧化系统中的重要组成部分，因此组织中SOD和GSH-Px活性的变化，可以动态地体现机体的抗氧化能力。李政媛等[16]研究发现去卵巢组大鼠心肌T-SOD和GSH-Px的活性明显减弱，经维生素E治疗模型大鼠心肌的抗氧化能力有所恢复，说明维生素E可提高绝经后大鼠心肌抗氧化能力,其主要抗氧化作用是通过增加体内雌激素水平,通过雌激素途径发挥的。明确了绝经后大鼠心肌组织的氧化应激平衡系统被破坏，同时确定了雌激素对绝经后心脏的保护机制与氧化应激存在密切的关系。本实验结果发现，大鼠去卵巢12周后，其心肌ROS 和MDA含量明显增加，GSH-Px活性明显下降，说明氧化应激系统的平衡被破坏，这一结果与之前的报道保持一致，在此基础上，我们课题组发现经高剂量枸杞多糖干预后，去卵巢大鼠心肌ROS 和MDA含量有所下降，GSH-Px活性明显升高，由于活性氧本身在体内能产生破坏性更强的羟自由基,少量就能诱导多种细胞凋亡。本实验发现绝经后大鼠心肌ROS明显升高的前提下，高剂量枸杞多糖对心肌细胞的保护作用可能与大剂量的枸杞多糖解除了SOD-H2O2复合物中的H2O2而使 SOD活性增加有关，提示枸杞多糖对去卵巢大鼠心肌的保护作用，可以通过其植物雌激素作用抑制氧化应激来实现。

PI3K 是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，其被激活后可以产生第二信使 PIP3，然后与细胞内含有 PH 结构域的信号蛋白Akt结合，促进Akt的磷酸化。Akt能够参与细胞内多种细胞途径并调控多种细胞过程，在调节各种生长因子和其它胞外刺激诱导的心肌细胞存活、生长、增殖、保持功能和营养物质代谢上发挥了重要作用[17-18]。在氧化应激的过程中发挥重要的作用。硫化氢气体自被发现具有类似一氧化氮和一氧化碳的某些生理作用后，在心血管、神经、消化等多个系统受到诸多关注，内源性H2S发挥舒张血管、调节血压的效应在NO存在的条件下能够明显增强[19]。PI3K上调Akt的磷酸化以激活内皮型一氧化氮合酶，是调控内源性NO合成的最经典途径之一。基于以上理论，我们推测枸杞多糖可能通过调控PI3K/Akt信号通路影响去卵巢大鼠的心肌的改变。实验结果表明将大鼠摘除双侧卵巢3个月后，明显出现了血清雌激素水平的下降，给予补佳乐及高剂量枸杞多糖后，血清雌二醇水平虽然未达到正常水平，但得以明显改善；造模后大鼠出现了心肌细胞排列紊乱，细胞间隙增大，心肌组织的LDH和CK含量有所升高，说明去卵巢大鼠出现了心肌损伤，并且补佳乐及高剂量枸杞多糖可以改善以上情况，说明枸杞多糖可以通过其植物雌激素作用对绝经后大鼠心脏起到保护的作用；同时实验结果表明，模型大鼠血清NO及心肌组织H2S也发生了变化，枸杞多糖可以提高模型大鼠H2S的含量，但不能纠正NO的改变，提示我们枸杞多糖可以通过改善心肌H2S的含量而影响心脏血管的舒张功能而保护心肌细胞的病变。与此同时，我们还发现枸杞多糖可以提高去卵巢大鼠心肌eNOS蛋白及PI3K蛋白的表达和Akt蛋白的磷酸化水平，并且与补佳乐无明显差异，说明枸杞多糖对绝经后心血管疾病可以起到防治作用，部分机制可能是通过调控PI3K/Akt/eNOS通路、影响H2S的含量而发挥作用，与氧化应激也存在密切的关系，但这一过程错综复杂，尚待研究。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

LBP regulates PI3K/Akt/eNOS signaling pathways in ovariectomized rat myocardium to exert antioxidative effect

YU Ning1, YANG Fang4, LENG Xue2,3, ZHANG Ni2,3, WANG Jun-yan2,3, SONG Nan2,3

(1TheFirstClinicalCollege,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,2KeyLaboratoryofMinistryofEducationforTCMViscera-StateTheoryandApplications,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,3TranslationalMedicineResearchCenterofTraditionalChineseMedicineinLiaoningProvince,4TheSecondAffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China.E-mail: 1135843243@qq.com)

AIM: To observe the influence ofLyciumbarbarumpolysaccharide (LBP) on the PI3K/Akt/eNOS signaling pathways in ovariectomized rat myocardium. METHODS: Female SD rats (n=30) were divided into sham operation group, ovariectomized group, progynova group, high-dose LBP group and low-dose LBP group. The serum levels of estradiol, lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) were measured by ELISA. The myocardial contents of H2S and oxidative stress injury-related indicators were also detected. The morphological changes of the myocardium were observed with HE staining. The expression of eNOS and PI3K/Akt pathway-related proteins in the myocardium was determined by Western blot. RESULTS: Compared with sham operation group, the serum level of estradiol, the content of H2S, the activity of GSH-Px, and the expression of eNOS and PI3K/Akt pathway-related proteins in the myocardium in ovariectomized group were all decreased, and the levels of ROS and MDA in the myocardium were increased (P<0.05). The serum levels of LDH and CK were also increased. The arrangement of the myocardial cells was disordered, and the intercellular space was also increased in the ovariectomized group. Compared with ovariectomized group, the serum level of estradiol, the myocardial levels of H2S and GSH-Px, and the protein levels of eNOS and phosphorylated Akt were all increased in high dose group, while the levels of ROS and MDA in the myocardium were decreased (P<0.05). The serum levels of LDH and CK were also decreased. The morphological changes of the rat myocardium were improved in high dose group. CONCLUSION: LBP prevents and treats postmenopausal cardiovascular lesions through regulating PI3K/Akt/eNOS signaling pathways in ovariectomized rats.

Lyciumbarbarumpolysaccharides; Ovariectomized rats; Cardiovascular diseases; PI3K/Akt/eNOS signaling pathways

1000- 4718(2016)08- 1370- 06

2016- 01- 11

2016- 05- 24

辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室开放基金资助项目(No. F14-231-1-17)；辽宁中医药大学大学生创新创业训练计划(No. 201510162000002)

R285.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.005

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△通讯作者 Tel: 15104015589； E-mail: 1135843243@qq.com