杨璨　孙全　王微娜　耿帅鹏

摘要：【目的】克隆海岛棉品种新海15中单萜合成酶基因（GbTPS），研究其受黄萎病诱导的表达情况，为进一步研究该基因在棉花抗黄萎病中的功能打下基础。【方法】克隆GbTPS基因的开放阅读框（ORF）全长序列，对其蛋白序列进行生物信息学分析，并采用实时荧光定量PCR及病毒诱导的基因沉默对其抗病性进行分析。【结果】通过PCR扩增得到一个全长为1761 bp的ORF序列，命名为GbTPS（GenBank登录号：KP247548）。生物信息学分析发现，该基因编码586个氨基酸，预测分子量为67.7 kD，等电点为5.79。系统进化树分析结果表明，GbTPS属于Tps-g亚家族。GbTPS基因经黄萎病菌诱导后，表达量在4～24 h内显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于空白对照组。病毒诱导的基因沉默受黄萎病诱导后其病情指数为52.38，与对照组相比并无明显差异。【结论】GbTPS基因仅在棉花抗黄萎病的早期发挥积极作用。

关键词： 棉花；单萜合酶；GbTPS基因；黄萎病；实时荧光定量PCR

中图分类号： S562；Q344 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）05-0604-07

Abstract：【Objective】A monoterpene synthetase gene GbTPS was cloned from Gossypiumbar badense， and its expression induced by Verticillium wilt were analysed， in order to lay a foundation for studying resistance of cotton to Verticillium wilt. 【Method】The full-length open reading frame（ORF） of GbTPS gene was cloned， and its encoded protein was analysed by bioinformatics， the real-time fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR） and virus induced gene silencing was used to analyse resistance to Verticillium wilt. 【Result】Full-length ORF was obtained， with length of 1761 bp， and named GbTPS（Genebank accession number： KP247548）. The bioinformatics analysis showed that， the protein composed of 586 amino acids was coded by GbTPS gene， its predicted molecular weight was 67.7 kD， its isoelectric point was 5.79. Phylogenetic tree analysis showed that， GbTPS belonged to Tps-g subfamily. The expression of GbTPS gene was significant（P<0.05） or extermely significant（P<0.01） higher than that of blank control within 4-24 h after being induced by Verticillium dahlia. The disease index of virus induced gene silencing was 52.38， and had no significant difference with that of control. 【Conclusion】Only at the early stage， the GbTPS gene plays a positive role in resistance to cotton Verticillium wilt.

Key words： cotton； monoterpene synthase； GbTPS gene； Verticillium wilt； qRT-PCR

0 引言

【研究意義】棉花是一種重要的经济作物，在我国乃至世界的经济发展中有着重要地位，是棉制品和服装的重要材料来源，但生产中易受黄萎病菌的侵害而导致大量减产。萜类化合物是植物中种类最多的一类天然烃类化合物，又名类异戊二烯。目前，已分离到的萜类达4万多种（胡永健等，2007）。植物中的萜类化合物包括初生代谢物和次生代谢物，其中次生代谢萜类化合物具有抗病虫害的重要作用。随着分子生物学的发展，萜类合成的关键酶及其在防御作用中的分子机理逐渐成为植物防御研究中的热点之一。萜类合成酶（Terpene Synthases，TPS）是萜类合成过程中的关键酶，也是棉花抗黄萎病过程中的一种重要酶，如δ杜松烯合成酶是合成棉花抗毒素的关键酶（Tan et al.，2000）。……