李春杰，胡岩峰，王从丽

(中国科学院 东北地理与农业生态研究所 黑土区农业生态重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150081)



黑龙江省大庆市大棚蔬菜根结线虫种类和小种的鉴定

李春杰，胡岩峰，王从丽

(中国科学院 东北地理与农业生态研究所 黑土区农业生态重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150081)

摘要：为明确黑龙江省大庆市棚室内蔬菜上根结线虫的种类和小种，研究采用PCR技术鉴定线虫的种类和鉴别寄主法确定南方根结线虫的小种。结果表明，大庆市棚室内番茄和黄瓜上根结线虫仅为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，并且是1号小种，未发现其他种的根结线虫。图2，表2，参13。

关键词：根结线虫；种类鉴定；PCR技术；鉴别寄主法；黑龙江省

根结线虫(Meloidogynespp.)是一类危害非常严重的植物寄生线虫，也是蔬菜栽培中普遍发生的一种病害。受害作物年损失率约10 %，而其中由南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)4 种常见根结线虫造成的损失占90 %[1]。在我国南方地区根结线虫病发生相当严重，在寒冷的东北地区发生相对较轻，尤其在黑龙江省的露地蔬菜几乎没有发生，因为根结线虫在黑龙江省不能越冬。但是在黑龙江省的温室和大棚内由于受保护地密闭、高温、高湿和复种指数增加等因素影响，蔬菜根结线虫病发生呈逐年加重趋势。根结线虫对同一种作物的致病性存在显著的种间差异，因此，对根结线虫种类的鉴定和小种的确定是防治该病的前提条件。此研究通过PCR技术鉴定线虫的种类和鉴别寄主法进一步确定南方根结线虫的小种，为生产实践中有效防治当地蔬菜根结线虫病提供科学依据，从而更有针对性地选择抗病作物和品种及其防治措施。

1材料与方法

1.1样本的采集

从黑龙江省大庆市发病严重的大棚内挖取被根结线虫危害的番茄根和黄瓜根(黑龙江省大庆市农业技术推广中心提供)，装入封口塑料袋中，快递到实验室。挑取样品组织内根结线虫的数个单卵块，分别接种到灭菌沙土(2∶1)盆栽的番茄根附近(距根1 cm处打孔)进行大量繁殖，以供实验室PCR鉴定和下一步温室盆栽小种的鉴定。爪哇根结线虫由华南农业大学资源环境学院提供，寄主为空心菜；北方根结线虫由沈阳农业大学植物保护学院提供，寄主是番茄。挑取根上多个单卵块，分别接种到温室灭菌沙土盆栽的番茄根部进行繁殖，方法同大庆样品。

1.2根结线虫DNA提取

从植物根组织中挑取多个卵块，置于28℃培养箱孵化3 d～4 d。挑出已孵化的多条线虫放入无菌水中，并利用手术刀在解剖镜下将虫体切碎，将虫体及内含物(8 μl)转移至PCR管中，同时加入2 μl裂解液(10 × PCR buffer与20 mg·ml-1蛋白酶K等体积混合)。PCR管在-80℃冰箱冷冻30 min，随后放入PCR仪(Bio-Rad S1000TMThermal Cycler)中65℃条件下反应90 min，95℃下处理10 min使蛋白酶K变性。12 000 rpm离心5 min，取上清液(DNA模板)用于PCR扩增，或置于-20℃冰箱备用。

PCR扩增：

根据Blok等[2]设计的根结线虫rDNA序列的扩增引物F194/F195对检测根结线虫种群5S和18S的IGS保守序列间隔区进行扩增。PCR反应总体系为25 μl，包括10 × PCR buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，上游和下游引物0.4 μl，Taq聚合酶0.5 μl，DNA模板2 μl，加ddH2O至25 μl。PCR 扩增条件为：94℃预变性4 min，94℃ 变性30 s，53℃ 退火30 s，72℃ 延伸90 s，40 个循环后，72℃延伸10 min。采用根结线虫的特异性引物对大庆线虫群体进行检测，引物序列见表1。PCR反应总体系为25 μl，其中10 × PCR buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，上游和下游引物各0.4 μl，Taq聚合酶0.5 μl，DNA模板2 μl，加ddH2O至25 μl。PCR 扩增条件为：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，58℃ 退火45 s，72℃延伸50 s，40 个循环后，72℃延伸10 min。取5 μl PCR 扩增产物在1.5 %琼脂糖凝胶上电泳，电压为85 V。使用EP凝胶成像仪观察、照相和记录。

表1　不同种根结线虫引物序列参照表

1.3鉴别寄主法对小种的鉴定

用鉴别寄主试验方法鉴定南方根结线虫的小种。首先将烟草(Nicotianatabacum品种为NC95，由中国农业科学院烟草研究所王凤龙研究员提供)和番茄(Lycopersionesculentum品种为中蔬4号，从市场购买)播种育秧盘中，穴内装有灭菌的草炭土∶蛭石=1∶1(体积比)，每穴3株～5株苗，出苗40 d和20 d后移栽到装有灭菌的沙∶土=2∶1的小盆中，盆深10 cm，盆上口直径15 cm，装沙土1 100 g，移栽1周后接种线虫。棉花(Gossypiumhirsutum品种为泗棉3号，由江苏省农业科学院张宝龙研究员提供)直接播种到同样大小的沙土盆中，出苗10 d后接种线虫，每盆保苗1株。所有寄主接种根结线虫的量均为5 000个卵·(盆·株)-1，接种45 d扣盆调查每株根系上根结数量，根结的分级标准为：无根结的为0级；1个～2个根结的为1级；3个～10个根结的为2级；11个～30个根结的为3级；31个～100个根结的为4级，100个以上的根结为5级。0、1级为不亲和，用“-”表示；2级～5级为亲和，用“+”表示。根据线虫在上述寄主上的表现确定南方根结线虫的小种[7-9]。用亮蓝对根上卵块染色和用NaClO提取根内卵，方法参照Hussey和Barker等[10]。

2结果与分析

2.1PCR技术对根结线虫种的鉴定

利用引物F194/F195对大庆线虫、已知的北方和爪哇根结线虫的rDNA-IGS进行PCR扩增比较，凝胶电泳结果显示3个根结线虫群体均扩增出约750 bp的电泳条带(图1A)，说明大庆线虫是根结线虫属[2]。利用北方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫及象耳豆根结线虫的特异性引物均未扩增出电泳条带(图1B)，说明该线虫群体可能仅为单一的南方根结线虫群体。而且PCR扩增结果显示，采自大庆的两个线虫DNA样品持续扩增出片段大小约为399 bp的南方根结线虫特异性条带(图1B和图1C)，这与有关文献报道南方根结线虫的分子鉴定结果一致[3]。来自爪哇根结线虫(华南农业大学提供)群体和北方根结线虫(沈阳农业大学提供)群体的DNA样品分别经爪哇根结线虫和北方根结线虫引物PCR扩增后，分别获得了约517 bp的爪哇根结线虫及610 bp的北方根结线虫的特异性条带(图1C)，进一步说明了该研究方法的可靠性。

2.2鉴别寄主法对南方根结线虫小种的鉴定

以上PCR扩增结果显示大庆市的根结线虫群体为南方根结线虫。因为不同种根结线虫和南方根结线虫的4个生理小种对同一寄主的致病性存在差异，所以利用鉴别寄主法对南方根结线虫的小种作进一步鉴定。试验结果显示，番茄对大庆线虫的侵染非常敏感，根表有大量虫瘿和卵块形成，而在烟草和棉花上并未发现虫瘿(图2)，仅在烟草上提取到很少量的卵，棉花根上没有提取到卵(表2)，说明大庆市南方根结线虫群体为1号小种，参照Barker等[9]建立的不同种根结线虫和南方根结线虫不同小种对一些植物反应的鉴定系统。同时，北方根结线虫和爪哇根结线虫在番茄、烟草和棉花上的反应与Barker等的鉴定系统完全相符。

表2　不同寄主植物对根结线虫小种的测定结果

3结论与讨论

研究调查了大庆市棚室内番茄和黄瓜上主要根结线虫种群，采集样品经单卵块纯化培养后，利用PCR技术和鉴别寄主法对根结线虫纯化群体进行鉴定。研究结果表明，大庆市棚室内番茄和黄瓜上根结线虫种群为南方根结线虫，并且是1号生理小种。国内外研究显示，广泛分布在世界各地的南方根结线虫有4个小种，其中1号小种为优势小种，2号、3号和4号小种只分布于有限地区。廖金玲等[8]报道南方根结线虫几乎在全国均有分布。杨宝君[11]对我国不同地区15种植物根结线虫病害病原调查时发现南方根结线虫只有1号小种；喻盛甫等[12]对云南植物根结线虫调查结果显示南方根结线虫1号小种为优势种，2号和3号小种仅有零星分布。研究利用鉴别寄主的方法鉴定大庆市大棚内的南方根结线虫为1号小种，这与前人研究结论相符。研究的样品采集于黑龙江省大庆市大棚温室中，其气候条件不同于露地，由于大棚内每年种植两茬蔬菜，室内温度和湿度较大，适合需要较高温度的南方根结线虫的发生和繁殖。于秋菊等[13]采用形态学方法鉴定大庆市温室内的根结线虫为南方根结线虫。近年来，运用PCR技术是植物根结线虫种类鉴定的主要手段，同时结合传统形态学分类及同工酶分析等方法，为病原区根结线虫种类的快速、准确的检测提供了便利。本试验采用根结线虫特异性引物对大庆市大棚温室中根结线虫进行PCR鉴定，在形态学鉴定和鉴别寄主方法的基础上进一步证实了大庆市大棚温室中根结线虫为南方根结线虫。本研究结果对于大庆市大棚内蔬菜根结线虫病害选育抗病作物品种和采用抗病作物轮作防治根结线虫具有重要意义，为制定该病害可持续防治措施提供科学依据。

图1　根结线虫样品内参基因的PCR产物和特异性引物扩增种群DNA的PCR产物Fig.1　Electrophoresis patterns of PCR amplified Meloidogyne populations with specific primersA：3个根结线虫样品rDNA-IGS序列的PCR产物(包括大庆线虫样品、北方根结线虫和爪哇根结线虫)，Products of PCR amplified rDNA-IGS fragments using DNA samples of Meloidogyne spp.(Daqing isolate,M.hapla and M. javanica);B：特异性引物扩增大庆线虫样品DNA的PCR 产物，Species-specific PCR products using DNA samples of Meloidogyne spp. from Daqing.泳道1: rDNA-IGS序列的PCR 产物 Products of PCR amplified rDNA-IGS fragments using the primer set F194/F195；泳道2：北方根结线虫引物扩增的产物 Amplification products from reactions using the primer set Fhap/Rhap for M.hapla；泳道3：爪哇根结线虫引物扩增的产物 Amplification products from reactions using the primer set Fjav/Rjav for M.javanica；泳道4：南方根结线虫引物扩增的产物 Amplification products from reactions using the primer set Finc/Rinc for M.incognita；泳道5：花生根结线虫引物扩增的产物 Amplification products from reactions using the primer set Fare/Rare for M. arenaria；泳道6：象耳豆根结线虫引物扩增的产物 Amplification products from reactions using the primer set Fent/Rent for M. enterolobii;C:特异性引物扩增供试根结线虫种群DNA的PCR 产物，Species-specific PCR products using DNA samples of Meloidogyne spp..泳道1和2：用爪哇根结线虫引物扩增华南农大爪哇根结线虫的产物 Lines 1 and 2 were PCR products of population of M.javanica from South China Agricultural University with M.javanica primer(517 bp)；泳道3和4：用南方根结线虫引物扩增大庆根结线虫的产物 Lines 3 and 4 were PCR products of population of RKN from Daqing with M.incognita primer(399 bp)；泳道5和6：用北方根结线虫引物扩增沈阳农大北方根结线虫的产物(基因片段610 bp)Lines 5 and 6 were PCR products of population of M.hapla from Shenyang Agricultural University with M.hapla primer(610 bp)。M：Marker DL2000

图2　大庆的南方根结线虫在不同寄主上的表型反应Fig.2　Phenotypic response of M.incognita from Daqing on different hosts A:在番茄上的表型反应(品种为中蔬4号，蓝色为卵块) Phenotypic response on tomato (Zhongshu4,Blue points indicated egg masses)；B:在烟草上的表型反应(品种为NC95)Phenotypic response on tobacco (NC95)；C:在棉花上的表型反应(品种为泗棉3号)Phenotypic response on cotton (Simian3)

致谢：感谢黑龙江省大庆市农业技术推广中心金辉老师提供的番茄根和黄瓜根样品。

参考文献：

[1]刘维志. 植物病原线虫学[M]. 北京:中国农业出版社,2000.

[2]Blok V C,Phillips M S,Fargette M. Comparison of sequences from the ribosomal DNA intergenic region ofMeloidogynemayaguensisand other major tropical root-knot nematodes [J]. The Journal of Nematology,1997,29(1):16-22.

[3]Randig O,Bongiovanni M,Carneiro R M,et al. Genetic diversity of root-knot nematodes from Brazil and development of SCAR markers specific for the coffee-damaging species [J]. Genome,2002,45(5):862-870.

[4]Zijlstra C,Donkers-Venne D T H M,Fargette M. Identification ofMeloidogyneincognita,M.javanicaandM.arenariausing sequence characterised amplified region (SCAR) based PCR assays [J]. Nematology,2000,2(8): 847-853.

[5]Zijlstra C. Identification ofMeloidogynechitwoodi,M.fallaxandM.haplabased on SCAR-PCR: a powerful way of enabling reliable identification of populations or individuals that share common traits [J]. European Journal of plant pathology,2000,106(3):283-290.

[6]Blok V C,Wishart J,Fargette M,et al. Mitochondrial DNA differences distinguishingMeloidogynemayaguensisfrom the major species of tropical root-knot nematodes [J]. Nematology,2002,4(7):773-781.

[7]方中达. 植病研究法 [M] . 北京: 中国农业出版社,1998.

[8]廖金玲,蒋寒,孙龙华,等. 中国南方地区作物根结线虫种和小种的鉴定 [J]. 华中农业大学学报,2003,22(6): 544-548.

[9]Barker K R,Carter C C,Sasser J N. An advanced treatise onMeloidogyne.Volume II :Methodology [M]. Raleigh ,North Carolina State University Graphics,1985.

[10]Hussey R S,Barker K R. A comparison of methods of collectinginocula ofMeloidogynespp. including a new technique [J]. Plant Disease Reports,1973,57(12):1025-1028.

[11]杨宝君. 十五种根结线虫病害的病原鉴定[J]. 植物病理学报,1984,14(2): 107-112.

[12]喻盛甫,杨宝君,王秋丽. 云南植物根结线虫种类调查与鉴定 [J]. 云南农业大学学报,1990,5(4): 212-217.

[13]于秋菊,李景富,许向阳,等. 黑龙江省番茄根结线虫病病原鉴定及抗病种质资源筛选 [J]. 中国蔬菜,1999,1(3): 7-10.

Identification of Species and Races of Root-knot Nematodes in Greenhouse from Daqing City in Heilongjiang Province

LI Chunjie,HU Yanfeng,WANG Congli

(KeyLaboratoryofMollisolsAgroecology,NortheastInstituteofGeographyandAgroecology,CAS,Harbin150081,China)

Abstract：To identify species and races of root-knot nematodes isolated from tomato and cucumber plants in the greenhouse of Daqing District,Heilongjing Province,PCR technology and differential host test were used. The results indicated that the root-knot nematode was only southern root-knot nematodes Meloidogyne incognita,and its race 1.

Key words：root-knot nematodes；species and race identification；PCR technology；differential host test；Heilongjiang province

中图分类号：S154.38+6

文献标识码：A

第一作者简介：李春杰(1976-)，女，黑龙江依安人，博士，副研究员，主要研究方向为作物病虫害生物生态控制.通讯作者：王从丽(1973-)，女，河南唐河人，博士，研究员，博士生导师，研究方向为植物寄生线虫病害发生机理和防治.

基金项目：国家自然科学基金(31471749)和中国科学院“百人计划”项目.

收稿日期：2015-10-28；修回日期：2015-11-04.

文章编号：2095-2961(2016)02 -0105-05

doi:10.11689/j.issn.2095-2961.2016.02.006