刘亚举，张俊涛，金海英，石美森（.许昌市公安局刑事科学技术研究所，河南许昌6000；.襄城县公安局刑侦大队，河南襄城6700；.宁波海尔施基因科技有限公司，浙江宁波5000；.中国政法大学证据科学教育部重点实验室，北京00088）



六色荧光标记快速PCR扩增体系的建立及验证

刘亚举1，张俊涛2，金海英3，石美森4
（1.许昌市公安局刑事科学技术研究所，河南许昌461000；2.襄城县公安局刑侦大队，河南襄城461700；3.宁波海尔施基因科技有限公司，浙江宁波315000；4.中国政法大学证据科学教育部重点实验室，北京100088）

摘要：目的建立PCR快速扩增程序和体系，并对其技术指标进行验证。方法采用六色荧光标记技术，对24个常染色体STR基因座、1个Y－STR基因座和Amelogenin、Y－InDel基因座进行复合扩增及毛细管电泳检测，同时考察体系的灵敏度、特异性、同一性、稳定性、混合样本及批量样本测试，并观察各种常见检材及降解、脱落细胞检材的分型情况。结果所建立的体系灵敏度达0.0625ng，快速扩增仅耗时65min就可获得准确分型；种属特异性高；各种纸质血样本和混合、降解、脱落细胞检材的分型正确。结论本研究建立的快速扩增体系可显著提升检验速率，分型准确、稳定，对建立STR数据库、研究群体遗传学和进行法医学鉴定有重要意义。

关键词：法医遗传学；短串联重复序列；快速PCR；复合STR扩增试剂

STR分型是目前法医学检验中DNA分型技术的核心，而PCR扩增反应是DNA检验中的关键环节，常规PCR扩增过程需要约3 h，如果能进一步缩短，将有利于提高鉴定效率。快速PCR扩增在保证各项性能指标的前提下，能实现较短时间内高效扩增目的片段［1］，现有商品化的GlobalFilerTMExpress试剂盒（美国AB公司）［2］使用六色荧光标记技术，且提高了STR检测数量。本研究采用快速PCR扩增和六色荧光标记技术，构建一个新的复合扩增检测体系，包含24个常染色体STR基因座、1个Y－STR基因座和Amelogenin、Y－InDel基因座，并对其性能指标和法医学应用进行评估。

1　材料与方法

1.1样本

河南汉族数据库无关个体血样1 136份，其中血样载体为FTA卡250份、定量滤纸250份、公安部物证鉴定中心研制的（公安）卡250份、武汉骥腾科技有限公司研制的（武汉）卡250份、其他纸质136份；案件检材200份，包括血痕、唾液斑、肌肉组织、肋软骨、带毛囊毛发、降解检材、脱落细胞检材。样本均来源于日常检案积累。实验室用标准品DNA：9947A和007（美国AB公司）、9948（美国Promega公司）。

1.2DNA提取和定量

上述案件样本采用磁珠法利用自动化工作站提取DNA［3］，使用BioSpectrometer D30核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf公司）进行纯度分析。

在epMotion P5073自动移液工作站（德国Eppendorf公司）构建PCR定量加样程序，使用Mastercycler® ep realplex定量PCR仪（德国Eppendorf公司）进行定量。

1.3复合扩增体系的建立

1.3.1引物设计及标记

24个常染色体STR基因座、1个Y－STR基因座和Amelogenin、Y-InDel基因座序列信息查自GDB数据库［4］，相关信息见表1。

表1　24个常染色体STR基因座、1个Y－STR基因座和Amelogenin、Y-InDel基因座的相关信息

1.3.2PCR扩增

PCR反应总体积为10μL［5］，内含DNA模板0.5～1ng和PCR Master Mix［1mol/L Tris－HCl（pH=8.0）、4 mol/L KCl、4 mol/L Betaine、1 mol/L Mg2SO4、10% Tween 20、dNTP、HS－Taq］5μL、4×Primer Mix［5］（含有荧光标记和未标记的引物等）2.5μL，其中PCR Master Mix和4×Primer Mix由宁波海尔施基因科技有限公司合成。在Master cycler pro S银座热循环仪（美国Eppendorf公司）上进行复合扩增，热循环条件［5］：95℃5min；94℃5 s，61℃50 s，27～30个循环；60℃15min；4℃保温。扩增用时65min（27个循环）～69min （30个循环）。其中血样载体样本27个循环，案件中的微量和降解检材30个循环，其他案件中的普通检材28个循环。

1.4电泳与分型

取1μL扩增产物与0.5μL内标SIZE－500（宁波海尔施基因科技有限公司）和8.5μL去离子甲酰胺混合，在3500XL型遗传分析仪（美国AB公司）上进行毛细管电泳，Collection软件收集数据，用GeneMarker® HID分析软件（美国SoftGenetics公司）进行等位基因分型，并采用GeneMapper ID－X软件复核分析。

1.5快速扩增体系技术指标验证

灵敏度检测样本：男性样本标准品9948，用定量PCR方法进行定量后，分别以4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125ng的模板DNA进行扩增检测，平行重复3次。

特异性检测样本：马、狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鸭、鼠、兔、鱼等动物DNA样品（购自中国检验检疫科学研究院），根据说明书稀释到1.0ng/μL；大肠杆菌DNA样品（购自中科院微生物研究所），根据说明书稀释到1.0ng/μL。平行重复3次。

同一性检测样本：60例同一男性个体血痕、唾液斑、肌肉组织、肋软骨、带毛囊毛发，经DNA提取与定量后，采用本研究方法检测，与采用GlobalFilerTMExpress试剂盒进行分型检验的结果进行比对。

稳定性检测样本：在0.5ng男性标准品9948中加入不同抑制物，血红素80、120、160、200、300μmol/L；EDTA 0.6、0.8、1.0μmol/L；腐殖酸5、10、20 ng/μL；钙离子1.0、1.5、1.75mmol/L。平行重复3次。

男男混合样本：将质量浓度为1.0 ng/μL男性标准品9948和007按V（9948）:V（007）=19:1、9:1、4:1、7:3、3:2、1:1、2:3、3:7、1:4、1:9、1:19进行混合。平行重复3次。

男女混合样本：将质量浓度为1.0ng/μL男性标准品9948和女性标准品9947A按V（9948）:V（9947A）= 19:1、9:1、4:1、7:3、3:2、1:1、2:3、3:7、1:4、1:9、1:19进行混合。平行重复3次。

案件适用性检测样本：降解检材70份、脱落细胞检材70份，经DNA提取与定量后，采用本研究方法检测，与采用GlobalFilerTMExpress试剂盒进行分型检验的结果进行比对。

遗传多态性调查样本：河南汉族数据库无关个体血样1136份，按直径1.0mm取样进行直接扩增［5］。

1.6数据分析

采用本研究快速扩增体系扩增，所得STR检测图谱均与已知分型结果比对，以获得20个以上常染色体STR基因座分型正确且各等位基因峰高大于50RFU为有效分型；每个条件下的重复实验结果按照同一基因座出现该峰两次以上的原则进行综合分析。

分型效果分析指标包括：检出率（有效分型次数/重复次数）、非特异性扩增率（出现非特异性扩增的基因座数/24个基因座×重复次数）、等位基因丢失率（等位基因丢失条带总数/预计等位基因总条带数）［6］。

2　结　果

2.1方法准确性及峰值均衡性

本研究构建的复合扩增体系中等位基因分型标准物分型均在规定范围内，图谱清晰，各等位基因峰高均大于200RFU；各基因座相邻的两个等位基因片段差均在预期范围内；相邻基因座间无等位基因分型重叠；等位基因分型标准物和阳性对照DNA没有产生错误分型；在等位基因范围内出现的非等位基因峰均低于相邻等位基因峰高的20%。杂合子两峰高的比例均大于70%，同一荧光标记物不同基因座之间的峰高比例大于50%，不同荧光标记物间的峰高比例大于30%，峰值均衡（图1）。

图1　等位基因分型标准物和内标分型图谱

该快速扩增体系用时65min，男性样本在Y-InDel 和DYS391基因座上有分型出现（图2），而女性样本则没有（图3）。

图2　男性血样经快速PCR扩增后的分型图谱

图3　女性血样经快速PCR扩增后的分型图谱

2.2灵敏度

本研究方法最佳模板量在0.125～2ng；模板量低至0.0625ng也可获得完整STR分型，且峰值在合理的范围内，但检出率为98.65%、等位基因丢失率达10.22%（表2）；模板量大于2 ng时，仍可获得较好的分型结果，但出现拔起峰、渗透峰等杂峰。

表2　灵敏度验证的检测结果　（%）

2.3特异性、同一性及稳定性

种属特异性：采用本研究体系对马、狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鸭、鼠、兔、鱼和大肠杆菌样本进行检测，结果均未检见特异分型。

同一性：采用本研究体系检测同一男性个体血痕、唾液斑、肌肉组织、肋软骨、带毛囊毛发样本（DNA纯度为2.1，质量浓度为0.15 ng/μL），结果均获得相同分型，与GlobalFilerTMExpress试剂盒分型一致。

稳定性：采用本研究体系对加入不同抑制物的0.5ng标准品9948进行检测，结果均未出现基因座丢失现象，且各浓度扩增结果无差异。

2.4混合样本

标准品9948分别和007、9947A按11种比例混合，检测结果显示，比例为19:1和1:19时出现严重的等位基因丢失现象，但V（9948）:V（9947A）=1:19时Y-InDel和DYS391基因座的峰高仍与9947A分型的峰高相近；而比例为18:2和2:18时也出现部分基因座的等位基因丢失，但结果可以判读；其他比例混合时，各基因座均能得到清晰准确的分型，且峰的均衡性比例较为明显（图4），说明本研究所建体系对混合样本的个人识别具有一定意义。

图4　男女混合样本分型图谱［V（9948）:V（9947A）=3:7］

2.5常见载体及实际案例检材

采用本研究体系检测几种纸质血卡样本，结果均获得完整分型。对实际案例脱落细胞检材和降解检材（DNA纯度为2.1，质量浓度为0.15ng/μL）各70份进行分型检测，结果表明所有分型与GlobalFilerTMExpress试剂盒分型一致，而GlobalFilerTMExpress试剂盒的灵敏度为0.062 5～1 ng［7］，说明本研究的复合扩增体系能够用于法医学实践中微量、降解检材的DNA检验。

2.6遗传多态性调查

1136例河南汉族无关个体血样经本方法检测，结果与GlobalFilerTMExpress试剂盒［2］相同基因座的分型结果均完全一致，说明本方法具有较好的准确性和一致性。

在1136名河南汉族无关个体中，24个常染色体STR基因座［2，8］共检出347个等位基因、1 438种基因型。各等位基因的分布频率在0.0004～0.5260，所检测的24个常染色体STR基因座的H为0.630 3～0.9357，Pm为0.0070～0.1960，DP为0.804 0～0.9930，PEduo为0.214 6～0.793 0，PEtrio为0.369 8～0.884 6，PIC 为0.567 7～0.940 4；SE33基因座的群体遗传学参数（Pm除外）均为最高。累积个人识别率为1－4.879 3× 10－30，二联体累积非父排除率为1－2.3005×10－7，三联体累积非父排除率为1－2.3652×10－11。综上所述，本研究的D1S1656等24个常染色体STR基因座在河南汉族人群中具有良好的遗传多态性，适用于法医学亲权鉴定和个人识别。

3　讨　论

本研究通过利用优化了的PCR Master混合物，增强缓冲液系统抗抑制效应，建立了适合法医DNA检验的快速扩增体系和程序，可在较短的65min（27个循环）～69min（30个循环）内完成扩增，其中所使用的快速扩增仪的升、降温速率分别为6℃/s和4.5℃/s。另外在常染色体和性别基因座的基础上增加了Y-Indel 和DYS391可以辅助判断被检验样本性别，有利于提高快速检验时的识别能力。

为了便于国际DNA数据交换和共享，原CODIS系统的13个基因座和欧洲标准（ESS）的常用基因座被联合使用［9］，原有的五色荧光标记技术（5－dyeTM）不能满足需求，利用突破性的六色荧光6－dyeTM技术，更多数量的STR基因座可以形成单一复合扩增体系。本研究构建的六色荧光标记快速PCR扩增体系增加了中国DNA数据库中广泛采用的基因座D6S1043、Penta E和Penta D，总共27个基因座，不仅解决了与数据库中共用基因座共享的数量问题［10］，而且缩短了扩增时间，促进了DNA数据库的应用效能和发展前景。本研究遗传多态性调查结果显示，SE33基因座在中国人群中的各项群体遗传学参数（Pm除外）均为最高，检出45个等位基因、273种基因型，但由于其内部序列结构复杂［9，11－12］，虽然ESS将其作为建立DNA数据库的核心基因座，但在中国人群仍存在大量等位基因分型标准物范围外（off－ladder，OL）的等位基因［2，13－21］，因此需要克隆符合中国人群的Ladder，使其含有充足的标准等位基因，同时扩展panel、增加虚拟bin，以增强等位基因的自动化判读，减少OL的发生。

综上，本研究建立的六色荧光标记快速复合扩增体系（24个常染色体STR基因座、1个Y－STR基因座和Amelogenin、Y-InDel基因座），各项性能技术指标均符合法医DNA检验的需要，与其他方法相比具有较大的兼容性和较高的个人识别能力，在案件检验和数据库建设等方面有良好的应用前景。

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（本文编辑：柳燕）

Establishment and Verification of 6-color Fluorescent-labeled Rapid PCR Amplification System

LIU Ya－ju1，ZHANG Jun－tao2，JIN Hai－ying3，SHI Mei－sen4
（1.Institute of Criminal Science and Technology，Xuchang Public Security Bureau，Xuchang 461000，China；2.Criminal Investigation Team，Xiangcheng Public Security Bureau，Xiangcheng 461700，China；3.HEALTH Gene Technologies Incorporation，Ningbo 315000，China；4.Key Laboratory of Evidence Science，Ministry of Education，China University of Political Science and Law，Beijing 100088，China）

Abstract：Objective To establish the rapid PCR amplification program and system and to verify the technical indexes.M ethods PCR multiplex and capillary electrophoresis detection of 24 autosomal STR loci and one Y－STR loci using the 6－color fluorescence marking technology，as well as Amelogenin and Y－InDel.Meanwhile，sensitivity，specificity，identity，stability，m ixing and a batch of sample tests were investigated，and the genotype of various routine samples and degraded，exfoliated cell sampleswere observed. Results The sensitivity of the system was 0.062 5ng.In addition，the genotype could be detected accurately only around 65min via rapid amplification.The species－specificity was high and the genotyping of all kinds of dry blood specimens of filter paper and mixed，degraded，exfoliated cell samples were accurate.Conclusion The rapid amplification system can significantly improve the detection rate，and obtain accurate and stable genotyping results，which may be important implications for the establishment of STR database and study on population genetics and forensic identification.

Key words：forensic genetics；short tandem repeat；rapid PCR；multiplex STR detection

收稿日期：（2015－08－31）

通信作者：石美森，女，博士，教授，硕士研究生导师，主要从事法医物证学和群体遗传学研究；E－mail：shimeisen2000＠163.com

作者简介：刘亚举（1978—），男，副主任法医师，主要从事法医DNA检验和群体遗传学研究；E－mail：horse3697＠126.com

文章编号：1004－5619（2016）02－0109－05

中图分类号：DF795.2

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.02.008