陈小鑫， 王松华， 李东风

(华南师范大学生命科学学院，广州 510631)



去势对成年雄性斑胸草雀HVC-RA突触可塑性的影响

陈小鑫， 王松华， 李东风*

(华南师范大学生命科学学院，广州 510631)

摘要：应用在体电生理方法研究了去势前后成年雄性斑胸草雀发声运动通路中HVC-RA 突触的可塑性变化，进一步探讨雄激素在调节鸣唱行为中的作用和机制.结果表明：低频刺激可引起 HVC-RA突触群体峰电位幅度的短时程抑制(Short-term depression, STD)，高频刺激可引起群体峰电位幅度的长时程抑制(Long-term depression, LTD).而去势后30 d，鸣曲稳定时再给予同样的条件刺激，发现无论低频或高频刺激，HVC-RA 突触的短时程抑制和长时程抑制现象同时消失.研究结果显示：鸣曲稳定性可能依赖于HVC-RA通路的突触可塑性，雄激素在维持鸣曲稳定过程中发挥重要作用.

关键词：去势； HVC-RA突触； 长时程抑制； 短时程抑制； 成年雄性斑胸草雀; 突触可塑性

鸣禽是动物界中较罕见的发声学习物种之一，其发声控制通路明确，与人类具有较高的同源性.其发声学习过程与人类的言语学习过程极为相似.对鸟鸣的研究有助于对人类语言及其中枢机制的理解.

鸣禽鸣唱系统中突触可塑性的研究一直是研究热点. 突触可塑性可分为短时程和长时程2种，通过控制一些调节因素，鸣唱通路中的突触可塑性可发生改变.研究表明，雄激素、乙酰胆碱(Ach)、致聋等因素都会影响突触可塑性[1-3]. 在幼年时期鸣禽的RA回返性侧枝突触可以产生LTD，在幼鸟中埋置睾酮则会诱发鸣唱提前固化，此时则不能诱导出LTD[1]，而HVC、RA具有雄激素受体，可以预见雄激素对HVC-RA突触可塑性可以产生影响.

课题组前期研究结果表明，在成年雄性班雄草雀中，用高频刺激可以诱导出HVC-RA的长时程抑制，低频刺激可诱导HVC-RA的短时程抑制[4].伴随着鸣禽习得性发声及HVC-RA通路上结构和功能上的发育，HVC-RA通路的突触可塑性也随之变化.鸣禽体内性激素浓度的季节性变化不仅改变HVC和RA的形态学特征，也可以通过改变RA 的电生理学特性，进而影响鸣禽的鸣唱行为[5-6].

研究[7]表明，雄激素有稳定鸣曲降低可塑性的作用.本实验室的前期工作[8]已经证实，成年雄性斑胸草雀在去势30 d后血浆中睾酮含量显著性下降，且主题曲相似性下降，音节熵值升高.幼年期雄激素会影响鸣唱系统中的RA回返性侧枝突触的突触可塑性变化，成年雄激素的含量降低后，对斑胸草雀HVC-RA鸣唱运动通路的突触可塑性产生何种影响呢？本文通过观察去势后发声运动通路中的突触可塑性的变化，为阐明雄激素对突触可塑性和学习记忆的调控机制提供实验证据.

1材料与方法

1.1材料

斑胸草雀(zebra finch,Taeniopygiaguttata)为年龄大于90 d成年雄性，体质量约12～15 g，购买于广州花地湾花鸟鱼虫市场.在鸟房中饲养，自然采光，喂食小米和水.分为对照组(7只)和去势组(9只).

仪器：刺激器 A300(WPI，USA)，放大器DAM70 (WPI，USA)，模数转换器ADC42(Pico Technology Limited，UK)， LTP软件(Version 2.4).刺激电极为外被绝缘漆双股镍铬合金丝，平行距离约0.4 mm.记录电极为单管玻璃微电极(Sutter Instrument Company，USA)，P-97 微电极拉制器(Sutter Instrument Company，USA)拉制即用，充灌0.5 mol/L的醋酸钠溶液，电极阻抗为1～6 MΩ，记录电极通过银丝与DAM70放大器的记录线相连.

1.2方法

1.2.1实验组设置对照组(Sham)：健康成年雄性斑胸草雀进行在体电生理实验.去势组(Castration)：去势手术30 d待鸣曲稳定后进行在体电生理实验.

1.2.2在体细胞外场电位记录取成年雄性斑胸草雀，胸大肌注射20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉.鸟头固定与电极的立体定位后进行电生理记录：记录电极定位到最佳诱发反应的位点，应用不同刺激强度(0～2 mA)的配对脉冲进行输入输出测试，以确定检测刺激强度.检测刺激采用时间间隔为50 ms的配对方波刺激，强度为引起最大诱发反应1/2～2/3的刺激强度，波宽为0.1 ms，延时20 ms，采样时间为120 ms，采样间隔为30 s，诱发场电位记录每4次进行叠加平均，利用LTP2.4软件记录原始电位图形. 用检测刺激稳定记录0.5 h后再开始进行条件刺激的诱导.

突触可塑性诱导：采用低频刺激(3 Hz)和高频刺激(400 Hz)2种.条件刺激后仍采用上述检测刺激进行检测，再记录 1 h.用LTP24进行数据记录.

记录指标为配对脉冲诱发的第一个和第二个群体峰电位的幅度，应用WinLTP1.11b软件进行该指标的离线提取.将数据相对于基线进行标准化处理，数据用均值±标准误差(Mean±SEM)表示，配对t-检验计算条件刺激诱导前后的差异性.使用Origin 8.0软件绘制原始电位图和统计图.电生理实验结束后，切片镜检确定记录电极尖端位置.

2结果与分析

2.1去势对低频刺激引起的HVC-RA短时程抑制的影响

2.1.1对照组低频刺激引起HVC-RA突触诱发群体峰电位的短时程抑制低频刺激诱导下，对于间隔 50 ms 的配对脉冲引起的第1个群体峰电位(图1A、B)，与诱导前(-2 min)相比，20 min 时电位幅度表现有显著性减小的趋势.与诱导前(-2 min)相比，60 min 时电位幅度无显著性变化(图1C、D).对于第2个群体峰电位，与诱导前相比，20 min 时电位幅度显著性减小，60 min 时电位幅度出现降低趋势，但无显著性(如图1E、F).

2.1.2去势组低频刺激引起的HVC-RA短时程抑制现象消失去势后，低频刺激诱导下，对于间隔 50 ms 的配对脉冲引起的第1个群体峰电位，与诱导前(-2 min)相比，20 min 时电位幅度没有降低，60 min 时电位幅度也无显著性变化(图2C、D).对于第2个群体峰电位，与诱导前相比，20 min 时电位幅度呈现减小的趋势，没有显著性变化，60 min 时电位幅度也无显著性变化(如图2E、F).

2.2去势对高频刺激引起的HVC-RA长时程抑制的影响

2.2.1对照组高频刺激引起HVC-RA突触诱发群体峰电位的长时程抑制高频刺激(400 Hz，800脉冲)诱导下，对于间隔 50 ms 的配对脉冲引起的第1个群体峰电位，与诱导前(-2 min)相比，20 min 时电位幅度表现为极显著性的减小，60 min 时电位幅度均显著性降低(图3C、D).对于第2个群体峰电位，与诱导前相比，20 min 和60 min时电位幅度均表现为显著性地降低(如图3E、F).

(A)同次实验中记录到的配对脉冲引起的第1个和第2个群体峰电位(PS)的幅度变化；(B)图 A条件刺激前和条件刺激后第 20、 60 min 记录到的配对脉冲引起的诱发电位图；(C)低频刺激引起的第1个 PS 的幅度变化(n=7)；(D)图 C 中条件刺激前和条件刺激后第 20、60 min 数据的对比；(E)低频刺激引起的第2个 PS 的幅度变化(n=7)；(F)图 E 中条件刺激前和条件刺激后第 20、60 min 数据的对比.

图1低频刺激引起 HVC-RA突触诱发群体峰电位的短时程抑制

Figure 1Low frequency stimulation induced short-term depression of the amplitudes of evoked population spikes (PS).

(A)同次实验中记录到的配对脉冲引起的第1个和第2个群体峰电位(PS)的幅度变化；(B)图 A条件刺激前和条件刺激后第 20、60 min 记录到的配对脉冲引起的诱发电位图; (C)低频刺激引起的第1个 PS 的幅度变化(n=9); (D)图 C 中条件刺激前和条件刺激后第 20、60 min 数据的对比；(E)低频刺激引起的第2个 PS 的幅度变化(n=9)；(F)图 E 中条件刺激前和条件刺激后第 20、60 min 数据的对比.

图2去势后低频刺激对HVC-RA突触诱发群体峰电位的短时程抑制现象消失

Figure 2Low frequency stimulation could not induce short-term depression of the amplitudes of evoked population spikes (PS) via castration.

(A)同1次实验记录到的配对脉冲引起的第1个和第2个群体峰电位(PS)的幅度变化;(B)图 A 中条件刺激前和条件刺激后第 20、60 min 记录到的配对脉冲引起的诱发电位图;(C)高频刺激引起的第1个 PS 的幅度变化 (n=7);(D)图 C 中条件刺激前和条件刺激后第 20、60 min 数据的对比;(E)低频刺激引起的第2个 PS 的幅度变化(n=7);(F)图 E 中条件刺激前和条件刺激后第 20、60 min 数据的对比.

图3高频刺激引起HVC-RA突触诱发群体峰电位的长时程抑制

Figure 3High frequency stimulation induced long-term depression of the amplitudes of evoked population spikes (PS).

2.2.2去势组高频刺激引起HVC-RA长时程抑制消失去势后，高频刺激(400 Hz，800脉冲)诱导下，对于间隔 50 ms 的配对脉冲引起的第1个群体峰电位，与诱导前(-2 min)相比，20 min 时电位幅度显著性减小,60 min 时电位幅度有减小的趋势但没有显著性差异(如图4C、D).对于第2个群体峰电位，与诱导前相比，20 min和60 min时电位幅度均没有显著性的减小(如图4E、F).

3讨论

雄激素对脑的结构和功能具有调节作用，包括突触可塑性、学习记忆、认知、情绪、生殖等[9-10].

在哺乳动物中，LTD是小脑运动性学习记忆的细胞突触模式和神经基础，其本质是通过小脑蒲肯野氏细胞上的AMPA受体及其突触的长时程抑制(LTD)来完成[11].值得注意的是，从HVC到RA的输入主要有AMPA和NMDA 2种谷氨酸受体参与[12]，成年后HVC和RA突触后谷氨酸受体主要是AMPA受体，而脊椎动物的长时程可塑性大多由这2种受体共同参与.鸣禽的运动通路中突触可塑性的改变也许是由AMPA受体所介导的.有研究表明，LTP负责强化记忆的形成而LTD则选择核实记忆的内容.当去势后，由于血浆中雄激素的含量急剧下降限制了LTD的形成，导致无法再核实原本的信息，最终使得鸣曲发生了不稳定的变化.

临界型鸣禽斑胸草雀成年后，鸣唱结构定型维持不变，去势会引起成年后鸣禽鸣唱结构的可塑性变化[13].本实验室前期结果已经证实，去势30 d后鸣曲熵值升高稳定性下降，因此以去势30 d为时间节点来探讨可塑性变化.去势30 d后发现相较于正常情况，长时程抑制和短时程抑制现象消失，显示鸣唱运动通路中的LTD/STD对于鸣曲的维持稳定有着重要的作用.

LTP与LTD作为突触可塑性的2种存在形式，参与了神经系统中的学习记忆过程[14].尽管关于LTD的报道远没有LTP报道的多，但从神经系统的活动规律来看，要组成一个能学习的完整的神经网络，LTP和LTD都是不可或缺的，其相互影响调控着记忆的形成.如果突触强度由于LTP而一直增加，一段时间后，所有的突触效率都会达到一个较高水平，不可能再编码新的信息.为了使突触增强成为

(A)同次实验记录到的配对脉冲引起的第1个和第2个群体峰电位(PS)的幅度变化；(B)图A 中条件刺激前和条件刺激后第 20、60 min 记录到的配对脉冲引起的诱发电位图;(C)高频刺激引起的第1个 PS 的幅度变化 (n=8)；(D) 图 C 中条件刺激前和条件刺激后第 20、60 min 数据的对比；(E)低频刺激引起的第2个 PS 的幅度变化(n=8)；(F)图 E 中条件刺激前和条件刺激后第 20、60 min 数据的对比.

图4去势后高频刺激对HVC-RA 突触诱发群体峰电位长时程抑制现象消失

Figure 4High frequency stimulation could not induce long-term depression of the amplitudes of evoked population spikes (PS) via castration.

编码信息的有用机制，必须存在LTD选择性减弱某些突触强度，所以LTD的诱导可以使LTP免于过饱和，使记忆保持一定容量，提高相邻突触LTP诱导的敏感性，进而提高神经网络重建的精细度和灵活性.

在哺乳类动物当中，小脑一直以来被认作是与运动控制和运动学习有紧密联系的脑结构，能快速、准确地完成各种复杂的学习和记忆过程，是有别于海马脑区的认知型学习记忆的另一种重要的学习记忆类型，且LTD是小脑运动性学习记忆的细胞突触模式和神经基础.LTD在运动性学习中起着不断纠正操作错误的作用[15-16].这些结果提示，在鸣禽的鸣唱运动中LTD可能起着类似的作用.HVC-RA中也存在着LTD现象，这与我们实验室前期的研究结果相一致，本实验还发现斑胸草雀去势30 d鸣曲稳定性下降后LTD消失，猜测鸣禽的这种鸣唱运动需要LTD的参与，并且在此过程中LTD通过不断地纠正错误信号来维持鸣曲的稳定性.去势后LTD的消失可能导致某些突触强度减弱，使编码信息发生了紊乱，导致鸣曲的不稳定.

近年来，已经意识到突触传递的短时程可塑性可能具有重要的生理意义. 短时程突触可塑性与输入信号的处理有关，其可能通过突触前峰电位的时序信息与突触强度变化的转换，以助神经回路产生可变的输出信号[17].HVC-RA突触的传递效能有可能通过短时程可塑性将由听觉信号引起的突触前峰电位的时序信息转换为突触强度的变化，从而产生各种运动指令.由此可见，HVC在鸣曲产生中，尤其是处理鸣曲成分即音节的时序信息上起着关键的作用.

在鸣禽中关于STD的研究并不多见，我们的研究发现低频刺激诱导下，可诱发出HVC-RA通路的短时程抑制，而当去势30 d鸣曲发生变化后，短时程抑制的现象消失.提示我们STD的消失可能会使鸣唱行为被削弱.另外，STD被认为与神经网络短时加工有关，而本实验中STD的消失可能是HVC-RA的神经网络发生了偏差.

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【中文责编：成文英文责编：李海航】

The Effect of Castration on the Synaptic Plasticity of HVC-RA in Adult Male Zebra Finch (TaeniopygiaGuttata)

CHEN Xiaoxin， WANG Songhua， LI Dongfeng*

(School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Abstract：Songbirds are animal with the ability of vocal learning like human, and the neural basis of vocal learning is similar to the language learning of human. This study investigated the changes in synaptic plasticity of HVC-RA synapses in adult male zebra finches after castration with in vivo electrophysiology technique, analysed the potential functions and mechanisms of androgen in the process of modulating courtship song and song maintaining. The results showed that low frequency stimulation induced short-term depression, high frequency stimulation induced long-term depression in HVC-RA synapses of adult male zebra finches. When the singing was stable after castration, we found that low or high frequency stimulation could not induce long-term or short-term synaptic depression. These results suggested that the stability of singing may depend on HVC-RA synaptic plasticity, and androgens may play an important role in the song stability.

Key words：castration; HVC-RA synapses; long-term depression; short-term depression; adult male zebra finches; synaptic plasticity

中图分类号：Q955

文献标志码：A

文章编号:1000-5463(2016)02-0061-06

*通讯作者:李东风，教授，Email: dfliswx@126.com.

基金项目：国家自然科学基金项目(31472002)

收稿日期：2015-07-24《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n