李思源　何祖强（广州市药品检验所广州510405）



HPLC法测定帕司烟肼中间氨基酚的含量△

李思源何祖强（广州市药品检验所广州510405）

摘要：目的：建立帕司烟肼中间氨基酚检查方法，有效控制帕司烟肼产品中间氨基酚含量。方法：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相：甲醇-10%四丁基氢氧化铵溶液-0.05mol/L磷酸氢二钠-0.05mol/L磷酸二氢钠（100∶21∶450∶450），检测波长280nm。结果：方法在1.06～3.18μg/mL范围内线性关系好，相关系数r=0.9999（n=5）；加样回收率为99.7%，RSD=0.7%；仪器精密度高，多次进样RSD=0.7%（n=6）。结论：方法专属性强，分离度好，准确度高，能有效控制帕司烟肼中间氨基酚含量。

关键词：HPLC帕司烟肼间氨基酚

帕司烟肼是一种人工合成的新型抗结核药物，主要成分包括异烟肼（INH）和对氨基水杨酸（PAS），PAS通过延缓INH在体内的乙酰化过程，从而延长有效血药浓度时间，杀菌作用显著。但随着临床应用的推广，其不良反应越来越受到临床关注。帕司烟肼中所含间氨基酚对呼吸、中枢神经、消化及内分泌系统均有不同程度的毒性作用，长期服用可能导致肝肾功能衰竭、内分泌紊乱等严重后果。本次研究为国家标准提高任务，通过研究样品中间氨基酚含量，在原标准的基础上增订该检查项，采用HPLC法测定帕司烟肼中间氨基酚的含量。

1　仪器与试药

美国Waters 1525型高效液相色谱仪，包括泵、紫外检测器、自动进样器，柱温箱等；瑞士梅特勒托利多XS205DU型电子天平；瑞士梅特勒托利多MT-5型电子天平；Millipore纯水仪。

帕司烟肼9批（来源：广州白云山化学制药厂，批号：101111001、101111002、101111003；来源：贵州神奇制药有限公司，批号：110109、110110、110111；来源：重庆华邦凯胜制药有限公司，批号：PAS-20081001、PAS-20090501、PAS-20090901）；帕司烟肼对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100438-200401）；间氨基酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：101160-201001）。

2　方法与结果

2.1溶液的配制

供试品溶液的配制：取本品，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1mL中含1mg的溶液，作为供试品溶液（临用新制）。

系统适用性溶液配置：取帕司烟肼对照品和间氨基酚对照品适量，加流动相配制成每1mL中约含帕司烟肼1mg和间氨基酚1.8μg的混合溶液。

对照品溶液配制：取间氨基酚对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1mL中含1.8μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2色谱条件：色谱柱：Ultimata XB-C18（5um，25cm×4.6mm，）；流动相：甲醇-10%四丁基氢氧化铵溶液-0.05mol/L磷酸氢二钠-0.05mol/L磷酸二氢钠（100∶21∶450∶450）；流速：1mL/min；检测波长：280nm；进样量：20μL。

2.3系统适应性试验：在上述色谱条件下，取20μL，注入液相色谱仪，理论板数按间氨基酚峰计算不低于5000，异烟肼峰、间氨基酚峰和对氨基水杨酸峰的分离度均不小于1.5。

2.4色谱柱耐用性试验：取系统适用性溶液注入液相色谱仪，以间氨基酚峰理论塔板数，异烟肼峰、间氨基酚峰和对氨基水杨酸峰分离度为指标，比较4个牌号的色谱柱。结果4条色谱柱的系统适用性试验指标均符合要求（详见表1），供试品及对照品溶液图谱均可较好满足检验需要，故该法色谱柱耐用性良好。

表1　不同色谱柱系统适用性试验结果

2.5线性关系试验：精密称取间氨基酚对照品适量，用流动相稀释成浓度为1.06～3.18μg/mL的5个溶液，按上述色谱条件测定峰面积，绘制标准曲线图，计算回归方程为：y=17579x-1402.6，r=0.9999（n=5）。

2.6回收试验：取样品适量，以间氨基酚对照品溶液作为流动相，配制含帕司烟肼浓度为1mg/mL的溶液6份，作为回收试验溶液。按上述色谱条件分别测定峰面积，以外标法计算各试验溶液间氨基酚含量，计算平均回收率为99.7%，RSD=0.7%。

2.7定量限试验：取间氨基酚对照品适量，用流动相稀释制成浓度为0.35279μg/mL的溶液，作为定量限试验溶液。照上述色谱条件测定峰面积，按信噪比10∶1换算定量限为0.135μg/mL。

2.8精密度试验：取间氨基酚对照品溶液，照上述色谱条件连进6针，记录间氨基酚峰面积，峰面积RSD=0.6%。

2.9供试品溶液稳定性试验：取101111003、110111、PAS-20090901批供试品溶液在0、2、4、6、12h注入液相色谱仪，测定间氨基酚峰面积。结果三批样品均随着时间的延长，峰面积逐渐增大。因此，规定供试品溶液临用新制。

2.10测定样品：按“2.1”配制溶液，照上述方法测定，按外标法计算间氨基酚含量。结果见表2，典型图谱见图1。

表2　间氨基酚检查结果（%）

3　讨论

3.1检测波长的选择：以流动相为溶剂配制19μg/mL的间氨基酚对照品溶液，并进行紫外扫描，结果间氨基酚最大吸收波长为280nm，故选择280nm为检测波长。此波长下检测灵敏度高，可准确地测定间氨基酚含量。

3.2方法优越性：帕司烟肼现行标准为国家药品标准（试行）WS-10001-（HD-1289）-2002，各国药典均没有收载。原标准并无收载间氨基酚项，鉴于间氨基酚的毒性，本研究通过考察样品中间氨基酚含量及检测方法，增订该项。试验通过对比多个液相系统，摸索各色谱条件，最终发现该系统专属性、分离度、色谱柱耐用性更好。故以此拟定方法，并经方法学验证，确定方法精密度、准确性、线性等各项指标良好。

3.3将间氨基酚检查和含量测定方法统一：原标准含量测定采用高氯酸非水溶液滴定法，用结晶紫为指示剂。本次标准起草过程同时比较了碘量法（参照进口药品注册标准JX20000377帕司烟肼片）和高效液相色谱法。高效液相色谱法色谱系统与拟定间氨基酚检查项一致，使用对氨基水杨酸钠对照品和异烟肼对照品作为对照品，用外标法计算异烟肼和对氨基水杨酸相当于理论含量的百分含量（帕司烟肼中异烟肼和对氨基水杨酸理论百分含量分别为47.2%和52.8%），9批样品比较结果见表3。结果，异烟肼和对氨基水杨酸的分子比例为1∶1，碘量法的结果偏低。由结果可知，高效液相色谱法专属性更强，准确性更高；与间氨基酚检查项方法统一，操作更方便。

表3　含量测定方法结果比较

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Determination of content of m-aminophenol in pasiniazide by HPLC

Li Siyuan He Zuqiang（Guangzhou Institute For Drug Control）

Abstract：Objective：To establish the examination method of m-aminophenol in pasiniazide and to effectively control the content of maminophenol in pasiniazide products. Methods：The determination was performed on C18 column with methanol -10% of tetrabutylammonium hydroxide ammonium solution -0.05mol/L disodium hydrogen phosphate-0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate （100∶21∶450∶450 V/V/V/V）as mobile phase. The detection wavelength was set at 280nm. Results：When the method was in the range of 1.06～3.18μg/ml，the linear relation is good and the correlation coefficient was r=0.9999（n=5）; The sample recovery rate was 99.7%，RSD=0.7%; The instrument was with high precision and multiple injection RSD=0.7%（n=6）. Conclusion：The method is specific，with good separation and high accuracy. It can effectively control the content of m-aminophenol in pasiniazide.

Key words:HPLC Pasiniazide M-aminephenol

基金项目△名称：磷酸伯安喹全球基金项目（全球基金国家药品标准提高课题），编号：GF2012-38

中图分类号：R927.2

文献标识码：A

文章编号：1672-8351（2016）04-0007-02