胡　昕，米合热古力·司马义，崔世红，王　晶，闫　芳，孙　慧，黄　毅，齐曼古力·吾守尔(新疆医科大学第一附属医院呼吸科，老年病科，乌鲁木齐　80054;昌吉分院，新疆　昌吉　800)



新疆维吾尔族哮喘与ADAM 33基因S2、ST+4、ST+5位点多态性的相关性研究

胡昕1，米合热古力·司马义1，崔世红1，王晶2，闫芳1，孙慧3，黄毅3，齐曼古力·吾守尔3
(新疆医科大学第一附属医院1呼吸科，2老年病科，乌鲁木齐830054;3昌吉分院，新疆昌吉831100)

摘要:目的探讨解整合素-金属蛋白酶33基因(ADAM33)3个位点(S2、ST+4、ST+5)单核苷酸多态性与新疆维吾尔族成人支气管哮喘的相关性。方法提取206例新疆维吾尔族成人支气管哮喘患者(哮喘组)与140例新疆维吾尔族成人健康体检者(对照组)的血液基因组DNA，采用限制性片段长度多态性方法分析ADAM33基因S2、ST+4、ST+5位点单核苷酸多态性，并对其中部分进行基因检测验证。结果两组ADAM33基因S2位点3种基因型分布差异有统计学意义(χ2=6．779，P=0．034)，ST+4、ST+5位点3种基因型分布差异均无统计学意义(P＞0．05)。ADAM33基因S2、ST+4、ST+5位点等位基因频率分布差异均无统计学意义(P＞0．05);ADAM33基因ST+4 与ST+5位点存在着弱连锁不平衡;哮喘组Hap4(CCT)显著低于对照组(χ2=4．761，P=0．029)，Hap6(GAT)显著高于对照组(χ2=10．012，P=0．002)。结论ADAM33基因S2、ST+4和ST+5位点单核苷酸多态性与新疆维吾尔族成人支气管哮喘具有相关性，在维吾尔族群体中ADAM33基因很可能存在有特异性易感的单体型或保护性单体型。

关键词:支气管哮喘;解整合素-金属蛋白酶33基因;单核苷酸多态性

支气管哮喘(简称哮喘)是一种常见的异质性多基因遗传的呼吸道疾病，以气道慢性炎症和可逆性气流受限为主要特征。近30年来其发病率和死亡率仍呈逐年增加的趋势［1］。其发生、发展是基因-基因、基因-环境等共同作用的结果。解整合素-金属蛋白酶33基因(ADAM33，a disintegrin and metalloproteinase 33)基因是2002年通过定位克隆获得的第1个哮喘易感基因，其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)在不同种族、民族的人群中与哮喘及其相关表型的关系不尽相同。本研究采用病例-对照的研究方法，探讨ADAM33基因S2、ST+4、ST+5位点多态性与维吾尔族哮喘的关系，为哮喘个体化治疗和预后提供线索。

1　资料与方法

1．1临床资料选择2012年4月－2013年4月经新疆医科大学第一附属医院呼吸科门诊及住院明确诊断的维吾尔族哮喘患者206例(哮喘组)。选择同期维吾尔族健康体检者140例为对照组。哮喘诊断根据中华医学会呼吸病学分会哮喘学组2008年制定的支气管哮喘防治指南的诊断标准［2］。所有研究对象均为长期居住在新疆3代或3代以上、1个月内未接受糖皮质激素治疗者，采集血液样本前24 h内停用支气管扩张药。同时，排除合并呼吸衰竭、肺结核活动期、妊娠、心功能≥3级、肝功转氨酶≥200 U/L、肾功能不全、处于严重应激状态的患者。哮喘组:男性81例，女性125例，平均年龄(42．89±14．03) 岁;对照组:男性55例，女性85例，平均年龄(40．22±14．56)岁。两组年龄、性别差异均无统计学意义(P＞0．05)，具有可比性。本研究已通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审核，且所有受试对象均取得知情同意。

1．2主要实验仪器PCR反应扩增仪(加拿大BBI公司)，凝胶成像系统(Gene Genius公司)，U-3010紫外-可见分光光度计(Hitachi公司)。

1．3方法

1．3．1样本收集与保存分别采集两组研究对象的外周静脉血2 mL，保存于抗凝管中，2 h内置于－80℃冰箱中冷冻储存。

1．3．2基因组DNA提取用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因组DNA。

1．3．3 PCR扩增和SNP-RFLP检测步骤(1)PCR反应体系:总体系15μL，包括配制板0．5μL、10× Taq buffer 1．5μL、dNTP(2．5 mMeach)0．3μL、上下游引物(50 pmoL/μL)各0．2μL、Tap酶0．1μL、MgCl21．2μL、去离子水11μL(每个SNP的上下游引物和Tap酶见表1);(2)PCR反应条件:预变性95℃5 min，变性95℃30 s，退火68℃45 s，延伸72℃60 s，20个循环;每循环退火温度降低0．5℃，变性95℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃40 s，20个循环;修复延伸72℃6 min。(3)酶切体系:PCR反应体系10μL，10×Buffer R 1．5μL，酶(10 U/μL)0．1 μL，去离子水3．4μL，37℃温箱中过夜;酶切产物用琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下凝胶成像仪中观察结果并保存分析。(4)DNA序列测定:将扩增好的PCR片段送往上海生工生物工程有限公司行DNA序列测定。

表1　ADAM 33基因PCR引物序列与扩增参数

1．4统计学处理采用SPSS17．0软件进行统计学分析。两样本计量资料比较采用t检验，多样本计量资料比较采用F检验，组间基因型和等位基因频率的比较采用χ2检验，不同基因型和等位基因对哮喘的相对危险度用单变量Logistic回归分析。利用SHEsis软件进行基因连锁不平衡分析及单体型的构建，单体型频率＜0．03不进一步分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1 ADAM 33基因各位点的Hardy-W einberg遗传平衡定律的检验按照Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，均为P＞0．05，结果表明两组研究样本的群体代表性好，符合H-W遗传平衡定律(表2)。

2．2 ADAM 33基因各位点的基因型及等位基因频率哮喘组和对照组ADAM33基因S2位点3种基因型分布差异有统计学意义(P＜0．05)，ST+4、ST+ 5位点3种基因型分布差异均无统计学意义(P＞0．05)。ADAM33基因S2、ST+4、ST+5位点等位基因频率分布差异均无统计学意义(P＞0．05)(表3)。

表2　哮喘组和对照组中ADAM 33基因SNP位点的Hardy-Weinberg遗传平衡检测

2．3 ADAM 33基因各位点基因型检测结果对两组的部分研究对象的PCR扩增产物进行直接测序，验证SNP-RFLP检测结果，S2位点检测到了G/G、C/G、C/C 3种基因型，G等位基因为突变基因;ST+ 4位点检测到了A/A、A/C、C/C 3种基因型，C等位基因为突变基因;ST+5位点检测到了T/T、C/T、C/ C 3种基因型，T等位基因为突变基因。结果见图1 ～3。

表3　两组ADAM33基因3个SNP基因型与等位基因频率分布比较/例(%)

图1　S2位点基因型检测结果

图2　ST+4位点基因型检测结果

图3　ST+5位点基因型检测结果

2．4 ADAM 33基因连锁不平衡分析及单体型的构建ADAM33基因ST+4、ST+5位点之间存在着弱连锁不平衡。S2、ST+4和ST+5位点构建的8种单体型频率的组间分布差异有统计学意义(χ2= 19．098，P=0．004);哮喘组Hap4(CCT)显著低于对照组(χ2=4．761，P=0．029)，Hap6(GAT)显著高于对照组(χ2=10．012，P=0．002)(表4、5)。

表4　ADAM 33基因多态位点间的连锁不平衡分析

3　讨论

的不断改进，哮喘的发病率不但没有下降，反而有所升高。据不完全统计，全球约有1．5亿哮喘患者，各国哮喘的患病率为1．0%～13．6%［3］。我国哮喘的发病率也呈上升趋势，因此哮喘的防治早已成为一个值得关注的公共卫生问题。众多的研究显示，ADAM33基因参与了哮喘的发病机制，在不同种族、不同民族中表达不同［4－5］。

随着医疗技术水平的不断提高，平喘治疗方案

表5　ADAM 33基因多态单体型在维吾尔族哮喘组和对照组中的分布/例(%)

维吾尔族是新疆的主体民族之一，人口流动性小，与外界通婚较少，其遗传背景和生活方式较为一致。本研究显示，维吾尔族人群ADAM33基因S2位点多态性分布频率与汉族、高加索人群有所不同，提示该基因多态分布具有民族特异性。等位基因S2(G)、ST+4(C)和ST+5(T)位点不增加或减低哮喘的发病风险。Dijkstra等［6］对200例哮喘患者进行25年的跟踪研究，发现S2多态位点与第一秒用力呼气容积的过度下降显著相关，与哮喘的发病及病程均有密切关系。本研究与迟翔宇等［7］、Awasthi等［8］、de Faria等［9］的研究结果相似，即S2多态位点与哮喘的发病具有相关性。Awasthi等［8］研究显示，ST+5多态位点与儿童哮喘有关联性，与本研究结果不一致，原因有待深入研究。

本研究对ADAM33基因3个位点进行了连锁不平衡检验，发现ST+4与ST+5位点存在着弱连锁不平衡，哮喘组Hap4(CCT)、Hap6(GAT)2种单体型频率与对照组比较差异有统计学意义，推测在维吾尔族群体中ADAM33基因很可能存在有特异性易感的单体型或保护性单体型。有待进一步地研究ADAM33基因在哮喘的发生、发展过程中的作用及在气道重塑中的作用机制。

参考文献:

［1］National Institute of Health(NIH)．National Heart，Lung and Blood Institute(NHLBI)/World Health Organization(WHO)．Global strategy for asthmamanagementand prevention．Global Initiative for asthma［M］．United States:NIH Publication，2011: 1-55．

［2］中华医学会呼吸病分会哮喘学组．支气管哮喘的定义、诊断、治疗和管理方案［J］．中华结核和呼吸杂志，2008，31(3): 177-185．

［3］Trepka MJ，Martin P，Mavunda K，etal．A pilotasthma incidence surveillance system and case definition:lessons learned［J］．Public Health Rep，2009，124(2):267-279．

［4］Royce SG，Cheng V，Samuel CS，et al．The regulation of fibrosis in airway remodeling in asthma［J］．Mol Cell Endocrinol，2012，351(2):167-175．

［5］Arima M，Fukuda T．Prostaglandin D2 and T(H)2 inflammation in the pathogenesis of bronchial asthma［J］．Korean J Intern Med，2011，26(1):8-18．

［6］Dijkstra A，Vonk JM，Jongepier H，etal．Lung function decline in asthma:association with inhaled corticosteroids，smoking and sex ［J］．Thorax，2006，61(2):105-110．

［7］迟翔宇，王学群，王来城，等．支气管哮喘患者ADAM33基因S2位点多态性的研究［J］．临床肺科杂志，2011，28(1): 47-49．

［8］Awasthi S，Tripathi P，Husain N，et al．Association of ADAM33 gene polymorphisms with asthma in Indian children［J］．J Hum Genet，2011，56(3):188-195．

［9］de Faria IC，de Faria EJ，Toro AA，et al．Association of TGF-beta 1，CD 14，IL-4，IL-4R and ADAM33 gene polymorphisms with asthma severity in children and adolescents［J］．JPediatr Rio J，2008，84(3):203-210．

(本文编辑杨晨晨)

Association between polymorphism of S2，ST+4，ST+5 locus in ADAM 33 gene and bronchial asthma in Xinjiang Uyghur population

HU Xin1，M ihereguli Simayi1，CUIShihong1，WANG Jing2，YAN Fang1，SUN Hui3，HUANG Yi3，QimanguliW ushouer3
(1Department of Respiratory Medicine，2Department of Geratology，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi，830054，China;3Changji Branch Hospital，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Xinjiang Changji831100，China)

Abstract:Objective To investigate the association of the S2，ST+4，ST+5 locus in the ADAM33 gene polymorphism with bronchial asthma of Uygur adult population in Xinjiang．M ethods Extract DNA from 206 Uygur patients with bronchial asthma(asthma group)and 140 Uygur healthy individuals(control group)．PCR－RFLP was used to determine polymorphism of S2，ST+4，ST+5 locus in ADAM 33 gene，in which a part of the samples were chosen for genetic testing．Resu lts The comparison of three genotypes of the S2 in the ADAM 33 had statistical significance in asthma group and control group(χ2=6．779，P=0．034)．But ST+4 and ST+5 had no statistical significance(P＞0．05)．The comparison of allelic frequencies of S2，ST+4，ST+5 locus had no statistical significance(P＞0．05)．There was weak linkagebook=262,ebook=12disequilibrium between ST+4 and ST+5 in ADAM 33 gene;Linkage disequilibrium analysis showed that Hap4(CCT)in asthmatics was much lower than in controls(χ2=4．761，P=0．029)，while Hap6 (GAT)wasmuch higher than in controls(χ2=10．012，P=0．002)．ConclusionThe Polymorphism of the S2，ST+4，and ST+5 locus in the ADAM 33 gene had significant correlation with bronchial asthma of Uygur population of adults in Xinjiang．The susceptible and protective haplotypes of asthmaticsmay exist in Uygur population．

Keywords:bronchial asthma;ADAM33gene;single nucleotide polymorphism

［收稿日期:1015-12-06］

通信作者:齐曼古力·吾守尔，女(维吾尔族)，主任医师，教授，博士生导师，研究方向:支气管哮喘的临床应用与基础研究，E-mail:qimenw@hotmail．com。

作者简介:胡昕(1983－)，女(汉族)，在读博士，主治医师，研究方向:支气管哮喘的临床应用与基础研究。

基金项目:国家自然科学基金(81160004，81100026)

doi:10．3969/j．issn．1009-5551．2016．03．002

中图分类号::R562．2+5

文献标识码:A

文章编号:1009-5551(2016)03-0261-04