刘宇麒　张英　宗宪春

摘要 以长寿花幼嫩叶片为外植体，研究不同灭菌时间对长寿花幼嫩叶片再生能力的影响以及不同激素配比对愈伤组织诱导、不定芽诱导和生根诱导的影响。结果表明：长寿花幼嫩叶片最佳的灭菌方式为75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗4次，再用0.1%升汞消毒7 min，无菌水冲洗5次；愈伤组织诱导的最适培养基配方为MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L；不定芽诱导分化的最适培养基配方为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；不定芽诱导生根的最适培养基配方为1/2 MS+IBA 0.2 mg/L。

关键词 长寿花；嫩叶片；组织培养；快速繁殖

中图分类号 S682.035.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）07-0143-02

Abstract The research using explant from seeding leaf of Kalanchoe blossfeldiana，the regeneration ability of the leaf was tested under different duration of sterilization，and the effects of different hormones combination on the induction of callus、adventitious buds and roots of Kalanchoe blossfeldiana.The results showed that the best way of sterilization was sterilizing the leaf in 75% ethanol for 30 seconds，washing 4 times with disinfection water，then in 0.1% mercury bichloride for 7 minutes and washing with disfection water for 5 times；the optimum medium for the induction of leaves was MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L；the suitable culture medium for bud differentiation and proliferation was MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；the optimum rooting medium was 1/2 MS+IBA 0.2 mg/L.

Key words Kalanchoe blossfeldiana；seedling leaf；tissue culture；rapid propagation

长寿花（Kalanchoe blossfeldiana），又叫矮生伽蓝菜、寿星花、假川莲，是景天科（Crassulaceae）伽蓝菜属（Kalanchoe）多年生肉质草本植物[1]。长寿花原产自马达加斯加岛，其花色鲜艳，花期长，观赏效果极佳，20世纪90年代初传入我国，近年随着进口花卉大量的进入中国市场，成为了一种极具发展潜力的“新品种花卉”[2]。

长寿花因其耐干旱、花期长、花色鲜艳、易栽培等特点在市场上深受消费者喜爱，是国际花卉市场发展最快的室内盆栽花卉之一。其繁殖方法一般是播种和扦插，但这2种方法都易受季节影响。笔者以长寿花叶片为外植体，以MS为基本培养基，研究不同激素配比对长寿花愈伤组织生长、不定芽诱导以及生根效果的影响，以期得到各培养阶段的最佳培养基配方，为国内长寿花组培苗工厂化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

健康的市售盆栽长寿花幼嫩叶片。

1.2 培养基及培养条件

1.2.1 培养基制备。基本培养基为MS或1/2 MS，各培养基蔗糖浓度为3%，琼脂成分为0.7%，pH值为5.8，121 ℃高压灭菌20 min[3-8]。

1.2.2 培养条件。温度23～26 ℃，光照时间12 h/d，光照强度1 000 lx左右培养[9-13]。

1.3 试验方法

1.3.1 外植体灭菌。取长寿花健康幼嫩的叶片，用流水冲洗10 min，移至超净工作台内操作，用75%乙醇对叶片进行消毒，无菌水冲洗4次，0.1%升汞消毒，无菌水冲洗5次。将灭菌后的叶片切成约0.5 cm×0.5 cm的小块接种在诱导愈伤培养基中，每瓶放置5小块，每个处理水平接种6瓶，即每个水平共接种30块外植体，置于培养室中培养，每天观测1次并记录，对不同消毒时长的消毒效果进行比较[14-18]。叶片消毒时长设置4个不同的处理水平，分别为75%酒精25 s+0.1%升汞3 min（A1）；75%酒精30 s+0.1%升汞5 min（A2）；75%酒精35 s+0.1%升汞7 min（A3）；75%酒精40 s+0.1%升汞9 min（A4）。

1.3.2 愈伤组织的诱导。取相同条件下消毒后的叶片进行切块，切成约0.5 cm×0.5 cm的小块，接种在不同激素配比的诱导愈伤培养基中，每瓶放置5小块，每个处理水平接种6瓶，即每个水平共接种30块外植体，置于培养室中培养，定期观测愈伤组织生长及增殖的情况并进行记录[19-20]。对激素配比设置5个不同处理水平，分别为MS+6-BA 0.2 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L（B1），MS+6-BA 0.2 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L（B2），MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L（B3），MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L（B4），MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.4 mg/L（B5）。

1.3.3 愈伤组织的芽诱导。把愈伤组织切成小块转接至分化培养基，每瓶放置5小块，每个处理水平接种6瓶，即每个水平共接种30块愈伤组织，置于培养室中培养，定期观测芽的分化情况，接种后30 d进行芽增殖数统计。对激素配比设置4个不同处理水平，分别为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L（C1），MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L（C2），MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L（C3），MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L（C4）。

1.3.4 根的诱导。待不定芽生长至2～3 cm高时，将健壮的单株芽苗切下转接至生根培养基中，每瓶放置5株，每个处理水平接种6瓶，即每个水平共接种30株芽苗，置于培养室中培养，观测不定根的生长情况并记录。对激素配比设置4个不同处理水平，分别为MS（D1），MS+IBA 0.2 mg/L（D2），1/2 MS（D3），1/2 MS+IBA 0.2 mg/L（D4）。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌时长对长寿花叶片灭菌效果的影响

接种15 d后对叶片的污染率、死亡率、成活率进行统计。处理A3、A4等2个处理污染率最低，分别为20%和30%；处理A1、A3等2个处理死亡率最低，分别为5%和10%；处理A2、A3等2个处理成活率较高，分别为45%和70%。因此，处理A3的处理方式为最佳，即先用75%酒精消毒30 s，再用0.1%升汞消毒7 min，消毒后外植体的污染率为20%，死亡率为10%，成活率为70%。

2.2 不同激素配比对长寿花叶片愈伤组织诱导的影响

以MS为基本培养基添加不同浓度的6-BA及2，4-D，接种30 d后观察各激素配比对愈伤组织生长情况的影响，并进行统计。

处理B1、B2、B3、B4、B5的诱导率分别为47%、87%、97%、53%、47%，其中处理B3的愈伤组织诱导率是最高的。因此，处理B3的激素配比为最佳，培养基配方为MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L，愈伤组织的诱导率达97%。

2.3 不同激素配比对长寿花不定芽诱导的影响

以MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA及NAA，将愈伤组织接种到继代分化培养基上，转接40 d后对不定芽的分化情况进行统计。处理C1、C2、C3、C4分化率分别为73%、80%、93%及73%，其中处理C3的不定芽分化率明显高于其他组。因此，处理C3的激素配比为最佳（图1），培养基配方为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，不定芽的分化率达93%。

2.4 不同激素配比对长寿花芽苗根诱导的影响

转接7 d后对不定根的生长情况进行统计。处理D1、D2、D3、D4的生根率分别为80%、93%、70%、100%，其中处理D4的生根率明显高于其他组，基部长出白色不定根（图2）。因此，处理D4的激素配比为最佳，培养基配方为1/2 MS+IBA 0.2 mg/L，芽苗的生根率可达到100%。

3 结论与讨论

通过对不同消毒时长影响长寿花叶片再生能力以及不同激素配比影响长寿花愈伤组织生长、不定芽诱导和生根效果的试验，长寿花嫩叶片最佳的消毒处理方式为：先用75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗4次，再用0.1%升汞消毒7 min，无菌水冲洗5次。消毒后外植体的污染率为20%，死亡率为10%，成活率为70%，这种外植体灭菌方法大大提高了无菌外植体建立的成功率。愈伤组织诱导效果及生长状况最佳的培养基配方为MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L；诱导不定芽分化的最适培养基配方为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，其芽分化的效果最好；诱导不定芽生根的最适培养基配方为1/2 MS+IBA 0.2 mg/L，基部长出粗壮白色的不定根。

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