焦淑珍 张正言 王林 徐盼 李琴琴 贾秋娥

摘 要 二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）是花青素生物合成途径中的关键酶，在花色的修饰中起重要作用，目前，已从多种植物中分离得到。从DFR基因的结构和作用机制、底物特异性、时空表达模式及花色修饰等方面进行了概括和总结，为DFR基因的进一步研究和利用提供理论依据。

关键词 二氢黄酮醇-4-还原酶；花青素；基因工程；调控机制

中图分类号：Q943.2 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.21.110

花色是评定观赏植物品质最重要的因素之一，对于花卉商品性和价值性起着决定性的作用。花色主要由类黄酮，类胡萝卜素，甜菜色素三种类型的色素组成[1，2]。类黄酮中的花青素是影响花色的主要色素，赋予花和果实从橘色到蓝色的所有颜色，如红色、粉色、蓝色和紫罗兰色等[3-5]。二氢黄酮醇4-还原酶（Dihydroflavonol 4-Reductase，DFR）是花青素代谢生化合成中的关键酶，是决定植物花色和果色从无色到有色的重要控制点，决定植物的花、果实、叶片等器官的着色[6]。因此，研究DFR基因的作用机理对于花色形成分子机制有重大意义。

1 DFR基因的结构和作用机制

二氢黄酮醇4–还原酶（DFR）是花色素苷生物合成途径中的关键节点基因，属于NADPH 依赖性短链还原酶家族或者是DFR亚家族，是单基因编码。这个亚家族的成员由肉桂酸、氧化还原酶为代表。它们都含有一个高度保守的NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐）结合位点“VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY”和一个由“TVNVEEKQKPVYDETCWSDVDFCRRV”组成的底物特异性结合区。此区域中第134位氨基酸和第145位的氨基酸会直接决定底物的特异性，并且在不同植物中相对保守[7]。DFR用NADPH作为辅因子催化二氢黄酮醇减少，从而生成相应的白花色素，这些无色花色素是花青素和原花青素的前体物。

在花青素合成途径中，DFR决定花青素苷最终的颜色，是花青素生物合成途径的关键酶（见图1）。分别催化二氢山奈酚（Dihydrokaempferol，DHK）、二氢槲皮素（Dihydroquercetin，DHQ）和二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DHM）生成无色花葵素（Leucopelargonidin）、无色花青素（Leucocyanidin）和无色翠雀素（Leucodelphinidin），无色的DHK、DHQ和DHM进一步在DFR 的催化下将上述产物还原成不稳定的无色花色素（Leucoanthocyanidin） [8，9]。

2 DFR基因的分离

1985年，O Reilly等从玉米和金鱼草中利用转座子标签法将DFR分离出来 。随后，在1989年，Beld等又以金鱼草DFR表型突变基因为探针分离了矮牵牛DFR基因。现已从拟南芥、非洲菊、玫瑰、兰花、百合、水稻、葡萄、紫色甘薯和草莓等植物中分别分离了DFR基因。Nakatsuka A.等对杂种百合花CHI和DFR基因的时空表达进行了研究，结果表明：LhDFR基因仅在花色素苷着色组织中表达，并且调控花器官的显色模式。

3 DFR基因的底物特异性

由于DFR对底物的特异性和表达水平不同，使植物呈现出不同的花色和果色。DFR可以催化三种无色的二氢黄酮醇底物，这三种无色的二氢黄酮醇底物为DHK、DHQ、DHM，形成无色花青素。三种DFR的底物的结由于B苯环羟基数不同底物亲和性有差别。例如，矮牵牛中DFR优先催化DHM，生成无色花翠素，其次催化DHQ，然而对DHK没有转化作用，因此，自然界中缺乏橙色的矮牵牛品系[10]；非洲菊中，DFR能同时催化DHK、DHQ、DHM三种底物，因此非洲菊中存在天竺葵色素；兰花中，DFR能有效的催化DHQ和DHM，但是却不能利用DHK。DFR第134位的氨基酸残基直接决定底物的特异性。对蔓越橘的研究表明，第134位氨基酸残基突变后，就会改变 DFR 的作用底物。

4 DFR基因的时空表达特性

不同植物中的DFR基因，在不同发育期和不同组织中时空表达特性有所不同。研究表明，矮牵牛中的3个DFR基因（DFRA、DFRB、DFRC），DFRA在花冠、花药和种子中高表达，在胚珠和茎中低表达[11]裂叶牵牛突变株DFR-B（J）基因由于含有转座因子Tpn1，此因子从DFR-B中去除后会引起体细胞突变，因而造成花色的多样性；亚洲百合的2个品种中，DFR基因在粉红色被片带有斑点的“Montreux”植株的花被片、花药、花丝、雌蕊和红色的鳞片中大量表达，然而在黄色被片无斑点的“Connecticut King”植株中仅在着色的在花药和鳞片中表达，此外两个植株的叶子、茎、鳞片中没有检测到DFR的表达，可见DFR基因仅在花器官着色的部位表达，且随着花的生长发育表达量增加，开花期达到最高。百脉根中存在着5个DFR基因，能产生不同的功能。结果表明，百脉根中DFR1在根、茎、叶、花、果实及豆荚等所有器官中均有表达，DFR2在除了叶的其他的器官中进行表达，而DFR3主要在叶片和茎中表达，DFR4和DFR5在根中微量表达[9]。这些研究结果表明，DFR基因表达量与花青素积累呈正相关，说明DFR催化反应是花青素合成中的重要步骤，对该基因的转基因遗传操作具有重要意义。

5 DFR与花色修饰

DFR是花色素苷生化合成途径中的一个关键酶，在花色的修饰中起重要作用，了解其转基因的研究不仅能更深一步了解DFR的功能，更有助于利用新方法，如调入新基因、RNA干扰等实现花色的修饰。世界上第一例利用基因工程手段改变花色的实例实Meyer等于1987 年将玉米DFR 基因导入矮牵牛RC01突变体，从而提供了天竺葵色素生物合成的中间产物，其花色由白色变为淡砖红色。1995年，Tanaka等[12]将玫瑰花瓣中克隆得到的DFR基因，利用分子生物学手段转入淡粉红色的矮牵牛中，从而产生了橙色矮牵牛。2000年，Aida[13，14]等将反义DFR基因导入蓝猪耳中，结果转基因株系的花冠花色素苷含量均有不同程度的减少，因此产生了多种新型图案。由于蓝猪耳转化植株中 DFR基因钝化，造成大量黄酮和黄酮醇的积累，导致蓝猪耳的花色显得更蓝。RNAi技术可以将某些特定基因特异性剔除或关闭，因此该技术已被广泛用于探索基因功能的研究领域，尤其作为一种有效修饰花色的方法被应用到了观赏植物的呈色调控中[15]。2004年，Fukusaki等利用RNA干扰（RNAi），用CHS mRNA的编码区作为RNAi的靶点从而特异诱导基因沉默，最终致使花色由蓝色变为白色或淡色。此外，控制羟基化模式，也能获得表达翠雀素型花青素的转基因康乃馨和玫瑰，现已被商业化生产[4，16，17]

6 展望

花色是花卉植物观赏价值的重要评价标准之一，尤其是罕见的蓝色花，具有极高的科研、生态和观赏价值，一直是花卉育种工作者的终极目标之一。传统的育种方法已不能实现花色的多样性，利用基因工程技术将目标基因转化到植物中以改变花色已变得可能。自1987年利用基因工程手段获得砖红色矮牵牛后，目前已分离了许多花色相关的基因，基因工程的发展为新品种的培育提供了有利的途径。但花色素受多种元件和因子调控，其形成途径是一个非常复杂的代谢过程，至今仍然很难随心所欲地进行花色修饰。随着花色基因工程的研究和分子生物学的不断进步，以及花青素途径各种转录因子和结构基因的机制的阐明，相信今后随着基因活性调控机制的揭示和基因工程技术的日趋成熟，人们必将创造出一个更加色彩缤纷的世界。

参考文献

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（责任编辑：刘昀）