周权明，杨小朋，钱章林，徐广建，王继超， 陈刚

(1石河子大学医学院，新疆石河子832000；2新疆维吾尔自治区人民医院；3苏州大学附属第二医院)

机械吹打法、胰酶消化法分离新生大鼠脑组织神经干细胞效果观察

周权明1，杨小朋2，钱章林2，徐广建2，王继超2， 陈刚3

(1石河子大学医学院，新疆石河子832000；2新疆维吾尔自治区人民医院；3苏州大学附属第二医院)

目的 对比观察机械吹打法、胰酶消化法分离培养新生大鼠脑组织神经干细胞(NSCs)的效果。方法 取出生3天的新生SD大鼠大脑皮质，分别用机械吹打法、胰酶消化法分离培养(分别记为机械吹打组和胰酶消化组)，通过免疫荧光法对NSCs进行鉴定和诱导分化；分别于培养第2、5、7天计数细胞球直径及数目；通过MTT法检测两组原代及第3亚代细胞的克隆增殖能力；选取第3亚代细胞进行冻存、复苏，计算细胞复苏后的存活率。结果 两组均可从新生SD大鼠大脑皮质分离得到NSCs，并均可诱导分化为神经元、神经胶质细胞。培养5、7天时，机械吹打组获得的细胞球数量和直径均高于相同培养时间的胰酶消化组(P均<0.05)。机械吹打组原代细胞培养2、5、7天细胞克隆增殖能力均高于相同培养时间的胰酶消化组(P均<0.05)，第3亚代细胞培养2、5 天细胞克隆增殖能力均优于相同培养时间的胰酶消化组(P均<0.05)。两组第3亚代细胞冻存、复苏后存活率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 机械吹打法、胰酶消化法均可成功分离培养、诱导分化新生大鼠NSCs，机械吹打法分离培养的NSCs克隆增殖能力高于胰酶消化法。

神经干细胞分离；机械吹打法；胰酶消化法；大脑皮质；大鼠

神经干细胞(NSCs)具有多向分化潜能和自我更新能力，能够分化为多种神经细胞[1]，在中枢神经系统创伤、缺血及退行性病变的治疗中具有广阔的应用前景。但目前NSCs的培养及冻存复苏技术尚不完善。2014年12月～2015年10月，本研究采用机械吹打法和胰酶消化法从新生鼠脑实质中分离培养原代NSCs，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：出生3天的清洁级SD大鼠25只，由新疆医科大学实验动物中心提供，许可证号SYXK(新)-2011-0004。主要试剂：基础培养基DMEM/F12(1∶1)，美国Gibco公司；青霉素-链霉素双抗，Hyclone公司；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)，英国PeproTech公司；抗巢蛋白抗体(Nestin)、神经丝蛋白200抗体(NF-200)、神经胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)、FITC、TRITC标记羊抗兔IgG、MTT试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 NSCs体外培养及形态学观察 取新生大鼠大脑皮质，解剖显微镜下用显微手术镊去除软脑膜和血管组织。用眼科剪将脑组织剪成约1 mm3的小块并随机分为机械吹打组及胰酶消化组。机械吹打组采用巴氏吸管轻微吹打，吹打后形成由大量单细胞和少量小细胞球组成的细胞悬液；胰酶消化组采用0.125%胰蛋白酶(含0.01% EDTA)消化组织10 min，以FBS终止消化，得到细胞悬液。用200目不锈钢滤网过滤细胞悬液，4 ℃、800 r/min离心5 min，弃上清。台盼蓝染色法计数活细胞，以1×106/mL密度分别接种细胞于25 mL培养瓶，37 ℃、5% CO2、饱和湿度环境下培养。培养基成分均为DMEM/F12(1∶1)、2% B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF。每2天半量换液1次。倒置显微镜下观察细胞生长状态，随机选取10个高倍视野，记数神经球的个数、直径及细胞分化情况。

1.3 NSCs鉴定及诱导分化 将两组原代细胞分别培养7天，收集形成的细胞球，按照1×106/mL密度进行传代培养。取传3代后形成的神经球，一部分接种于多聚赖氨酸包被的24孔板，于DMEM/F12(1∶1)培养基中培养2天，行Nestin多克隆抗体免疫荧光染色；另一部分接种于含10% FBS培养基中培养5天，行NF-200、GFAP多克隆抗体免疫荧光染色。倒置荧光显微镜下观察，拍照。

1.4 NSCs的克隆增殖能力观察 分别取上述两种方法获得的原代NSCs、传代后的第3亚代NSCs悬液，调整细胞密度为1×106/mL，各吸取100 μL悬液至96孔板，分别于培养第2、5、7天计数接种原代NSCs的培养孔中细胞球数量及直径；通过MTT法检测两组原代及第3亚代NSCs的克隆增殖能力，方法参照试剂盒说明书，酶联免疫检测仪上测定490 nm波长处各孔吸光光度值(OD值)。

1.5 NSCs冻存、复苏及存活率检测 选取两组第3亚代细胞进行冻存、复苏。冻存液由70% DMEM、20% BSA、10% DMSO组成。具体方法：取冻存后复苏的细胞悬液，台盼蓝染色，在计数板上计数四角大格内的细胞总数，计算细胞复苏后的存活率。存活率=存活细胞数/总细胞数×100%。

2 结果

2.1 NSCs形态学观察 培养2天时，倒置显微镜下可见机械吹打组出现悬浮的小细胞团，胰酶消化组基本处于单细胞状态。培养3～5天时，机械吹打组细胞团内细胞增多，形成由几十个到上百个圆球形细胞构成的细胞球，悬浮生长；胰酶消化组也可见细胞球，但数量和大小不及机械吹打组。培养6～7天时，机械吹打组可见含数十至数百个细胞的集落悬浮于培养基中，形态较之前更规则，有部分细胞球死亡，失去周围光晕，中央区暗淡；胰酶消化组上述改变弱于机械吹打组。

2.2 NSCs的鉴定和诱导分化 两组第3代细胞免疫荧光染色均可见红色荧光，即Nestin染色均阳性及NF-200、GFAP免疫荧光染色均呈阳性。

2.3 NSCs的克隆增殖能力 见表1、2。

2.4 第3亚代细胞冻存、复苏及存活率 两组冻存的第3亚代NSCs冻存前与冻存复苏后细胞形态、生长速度及其他生物学特性无明显差别， 细胞均悬浮生长，培养2～4天均形成干细胞球，Nestin免疫荧光染色均呈阳性。机械吹打组和胰酶消化组细胞复苏后存活率分别为85%、89%，两组比较P>0.05。

表1 两组原代NSCs不同培养时间细胞球直径和数量比较±s)

注：与胰酶消化组同时间点比较，*P<0.05。

表2 两组原代及第3亚代NSCs不同培养时间克隆增殖能力比较(OD值，±s)

注：与胰酶消化组同时间点比较，*P<0.05。

3 讨论

NSCs具有广泛的临床应用前景，有望用于治疗多种神经系统疾病。但是，由于控制NSCs增殖和分化的因素还不明确[2，3]，尤其是NSCs移植到受损中枢神经区域如何向特定神经细胞分化的机制还未取得突破性进展[4]。因此，探索NSCs分离培养、诱导分化的技术意义重大。

机械吹打法和胰酶消化法是分离培养NSCs的常用技术[5]，但不同实验室建立的培养体系不同，获得的NSCs增殖、分化能力等也不同[6]。胰酶消化法可以增加单细胞数量，但胰酶消化作用的最佳时间点难以把握，分离消化过程中多次离心可导致原代NSCs损伤[7]，且在终止胰酶消化过程中加入的FBS易诱导原代NSCs分化。机械吹打法仅通过机械吹打获得NSCs，避免了FBS对原代NSCs的影响。本研究两种方法均可获得NSCs，并可诱导分化为神经元、神经胶质细胞。但是在原代培养第5天及第7天，机械吹打法较胰酶消化法获得细胞球数量多、细胞球直径大；原代细胞培养第2、5、7天机械吹打法获得细胞克隆增殖能力明显高于胰酶消化组，第3亚代细胞在培养第2、5天机械吹打组细胞克隆增殖能力优于胰酶消化组。原因可能为机械吹打法获得的细胞悬液中存在大量小细胞团，可形成相对良好的微环境，NSCs通过自分泌或旁分泌产生的神经营养因子可在该环境局部达到相对高浓度，促进NSCs的生长增殖；而胰蛋白酶消化破坏了影响细胞存活的细胞基质、胞膜上的受体等，造成细胞化学损伤，反复的离心也增加细胞损伤的机会，形成的亚代克隆球的量较机械吹打法明显减少[8～11]。

NSCs的体外培养过程复杂，必须注重NSCs的体外冻存与复苏等环节[12]。本研究取第3亚代NSCs进行冻存复苏，结果显示两组冻存前与冻存复苏后细胞形态、生长速度及其他生物学特性无明显差别，细胞均悬浮生长，培养2～4天均形成干细胞球，Nestin免疫荧光染色均呈阳性，冻存复苏后细胞存活率分别为85%、89%，两组无明显差别，提示两种方法获得的NSCs体外冻存、复苏稳定。

总之，机械吹打法、胰酶消化法均可从新生鼠脑组织中成功分离培养NSCs，但机械吹打法分离培养的NSCs克隆增殖能力优于胰酶消化法。

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Effects of mechanical isolation and pancreatin digestant isolation in separating neural stem cells from brain tissues of neonatal rats

ZHOUQuanming1,YANGXiaopeng,QIANZhanglin,XUGuangjian,WANGJichao,CHENGang

(1MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832000,China)

Objective To compare the effects of mechanical isolation and pancreatin digestant isolation in separating neural stem cells (NSCs) from brain tissues of neonatal rats. Methods The cerebral cortex of newborn rats within 3 days were isolated and cultured by mechanical and pancreatin digestion, respectively. The NSCs were identified and differentiated by immunofluorescence assay. Diameter and number of cell spheres were detected on day 2, 5 and 7 of culture. The proliferation ability of the primary passage of NSCs and the third-passage NSCs in the two groups were compared by MTT. The third-passage NSCs were frozen and recovered and the survival rate of the cells was calculated. Results Both of these two methods could isolate NSCs from the cerebral cortex of neonatal rats, and those NSCs could be induced to differentiate into neurons and glial cells. On day 5 and 7, the NSCs′ ball number and diameter which came from the mechanical isolation group were higher than those of the pancreatin digestant group in the same culture time (allP<0.05). On day 2, 5 and 7, the prime NSCs which came from the mechanical isolation group had better clonal proliferation ability than those of the pancreatin digestant group in the same culture time (allP<0.05). On day 2 and 5, the third-passage NSCs of the mechanical isolation group had better clonal proliferation ability than those of the pancreatin digestant group in the same culture time (allP<0.05). The survival rates of the third-passage NSCs of the mechanical isolation group and pancreatin digestant group were respectively 85% and 89%, respectively; and there was no significant difference between these two groups (P>0.05). Conclusion Both mechanical isolation and pancreatin digestant isolation can successfully isolate NSCs. NSCs which come from the mechanical isolation group have better clonal proliferation ability than those of the pancreatin digestant group.

neural stem cells; mechanical isolation; pancreatin digestion; cerebral cortex; rats

国家自然科学基金资助项目(8116055)。

周权明(1987-)，男，在读硕士研究生，研究方向为中枢神经系统急性损伤。E-mail： 909073436@qq.com

杨小朋(1962-)，男，主任医师，研究方向为中枢神经系统疾病。E-mail： 307240766@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.006

R338

A

1002-266X(2016)20-0018-03

2015-11-13)