王 芳, 赵 青, 程慧芳, 张淑秋

(山西医科大学 药学院，山西 太原 030001)

·快递论文·

新型胆碱衍生物的合成及其体外抗疟活性

王 芳, 赵 青, 程慧芳, 张淑秋*

(山西医科大学 药学院，山西 太原 030001)

以N,N-二甲基乙醇胺和N,N-二乙基乙醇胺为初始原料，分别与不同碳链长度的溴代烷烃回流反应合成了6个新型的季铵盐型胆碱衍生物(3a～3f)，其结构经UV-Vis，1H NMR和HR-MS表征。初步抗疟活性测试结果表明：3a～3f对恶性疟原虫3D7的增殖均有一定的体外抑制活性，(1-羟基)二乙基正丁基溴化铵(3f)的活性最强[IC50(68.1±6.5) nmol·L-1]，但低于青蒿素[IC50(5.7±1.54) nmol·L-1]。

乙醇胺； 溴代烷； 季铵盐； 胆碱衍生物； 体外抗疟活性

疟疾作为全球最突出的公共卫生问题一直备受关注，而抗疟药物耐药性的出现则是近年来亟待解决的重要问题，研究新型抗疟药物具有重要的临床意义[1-2]。

研究[3]发现，疟原虫侵染宿主红细胞之后，为实现其快速生长繁殖所需的营养需要，会在感染红细胞膜上产生特异性代谢途径，诱导其表面产生红细胞胆碱转运体(erythrocyte choline carriers, ECCs)[4-6]，以主动识别和摄取宿主血清中的胆碱(主要是磷脂酰胆碱)，作为合成细胞膜磷脂的原料。正常哺乳动物成熟红细胞很少或几乎没有磷脂合成能力，因此，若以感染红细胞内磷脂代谢作为抗疟药的靶点，可望实现对红内期疟原虫的靶向性，而避免对正常红细胞的毒性。

Peyrottes等[7]报道一些胆碱衍生物可通过ECCs特异性地蓄积于疟原虫感染红细胞内，阻断磷脂酰胆碱的合成，表现出显著的抗疟活性。Marie等[8]报道一些胆碱衍生物对于恶性疟原虫的增殖有抑制作用，且其中季铵盐型胆碱衍生物的抗疟活性明显高于伯、仲、叔胺类胆碱衍生物。

本文以N,N-二甲基乙醇胺(1a)和N,N-二乙基乙醇胺(1d)为初始原料，分别与不同碳链长度的溴代烷烃(2a～2c)回流反应合成了6个新型的季铵盐型胆碱衍生物(3a～3f， Scheme 1)，其结构经UV-Vis，1H NMR和HR-MS表征。并以青蒿素为阳性对照考察了其对恶性疟原虫3D7生长繁殖的抑制作用。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker Avance 600型超导核磁共振仪(氘代氯仿为溶剂，TMS为内标)；LTQ Orbitrap型高分辨液质联用仪；Thermo Scientific 311型CO2培养箱；Variskan Flash型全波长多功能酶标仪。

N,N-二甲基乙醇胺，N,N-二乙基乙醇胺，溴乙烷，溴丙烷和溴丁烷，阿拉丁试剂有限公司；丙酮、无水乙醇、甲醛和氢氧化钠，天津北辰方正试剂厂；十六烷基三甲基溴化铵、四苯硼钠和达旦黄，国药化学试剂有限公司；青蒿素，重庆华方武陵山制药有限公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、次黄嘌呤、山梨醇和皂苷(Saponin)，美国Sigma 公司；富脂牛血清白蛋白(Albumax Ⅱ)和RPMI 1640，美国Gibco公司；SYBR GreenⅠ和二甲基亚砜(DMSO)，北京Biotiopped 公司；人O型红细胞和AB型血浆，山西省太原市红十字血液中心；恶性疟原虫3D7株，昆明医科大学杨照青教授惠赠。

1.2 3a～3f的合成通法

在反应瓶中依次加入取1 0.1 mol和无水乙醇100 mL，搅拌使其溶解；逐滴加入2 0.12 mol，加毕，于室温反应30 min；回流反应24 h。趁热抽滤，滤液旋蒸除溶得无色稠状液体，加丙酮35 mL溶解，冷却至室温，于-20 ℃静置2 h，抽滤得白色针状晶体，重复上述操作3次得白色固体3a～3f，产率70%～80%。

(1-羟基)二甲基乙基溴化铵(3a)： 白色针状固体，纯度91.0 %；1H NMRδ： 1.47(t,J=6.8 Hz, 3H, CH3), 3.37(s, 6H, NCH3), 3.68～3.76(m, 4H, CH2N), 4.02(s, 2H, OCH2); HR-MSm/z： Calcd for C6H16NOBr{[M-Br]+}118.122 6, found 118.122 4。

(1-羟基)二甲基正丙基溴化铵(3b)： 白色针状固体，纯度84.3%；1H NMRδ： 1.06(t,J=7.3 Hz, 3H, CH3), 1.82～1.86(m, 2H, CH2), 3.38(s, 6H, NCH3), 3.52～3.54(m, 2H, NCH2), 3.74～3.78(m, 2H, CH2N), 4.16(s， 2H， OCH2)； HR-MSm/z： Calcd for C7H18NOBr{[M-Br]+} 132.138 3, found 132.137 8。

(1-羟基)二甲基正丁基溴化铵(3c)： 白色针状固体，纯度98.7%；1H NMRδ： 1.01(t,J=7.3 Hz, 3H, CH3), 1.41～1.48(m, 2H, CH2), 1.74～1.80(m, 2H, CH2), 3.39(s, 6H, NCH3), 3.58～3.62(m, 2H, NCH2), 3.76(m, 2H, CH2N), 4.14(s, 2H, OCH2)； HR-MSm/z： Calcd for C8H20NOBr{[M-Br]+} 146.153 9, found 146.153 7。

(1-羟基)三乙基溴化铵(3d)： 白色针状固体，纯度93.4 %；1H NMRδ： 1.39(t,J=6.8 Hz, 9H, CH3), 3.52～3.60(m, 8H, NCH2), 4.15(s, 2H, OCH2)； HR-MSm/z： Calcd for C8H20NOBr{[M-Br]+} 146.153 9; found 146.153 7。

(1-羟基)二乙基正丙基溴化铵(3e)： 白色针状固体，纯度92.9%；1H NMRδ： 1.05(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3), 1.39(t, 6H, NCCH3), 1.74～1.82(m, 2H, CH2), 3.32～3.37(m, 2H, NCH2), 3.54～3.60(m, 6H, NCH2), 4.10(s, 2H, OCH2)； HR-MSm/z： Calcd for C9H22NOBr{[M-Br]+} 160.169 6, found 160.179 5。

(1-羟基)二乙基正丁基溴化铵(3f)： 白色针状固体，纯度81.6%；1H NMRδ： 1.02(t,J=7.0 Hz, 3H, CH3), 1.40(s, 6H, NCCH3), 1.42～1.48(m, 2H, CH2), 1.71(s, 2H, CH2), 3.35～3.40(m, 2H, NCH2), 3.57(s, 6H, NCH2), 4.11(s, 2H, OCH2)； HR-MSm/z： Calcd for C10H24NOBr{[M-Br]+} 174.185 2, found 174.185 0。

1.3 纯度测定

采用四苯硼钠返滴定法[9]对3a～3f的纯度进行测定。称取0.1 g待测化合物置于100 mL锥形瓶中，用100 mL去离子水溶解；依次加入0.1 mol·L-1四苯硼钠标准溶液3 mL，甲醛5 mL，质量分数为20%的NaOH溶液200 μL和质量分数为0.1%的达旦黄指示剂200 μL，摇匀，用0.5 mmol·L-1十六烷基三甲基溴化铵溶液滴定至终点(溶液由淡黄色变为淡粉色)，计算各季铵盐型胆碱衍生物纯度。

1.4 3a～3f对恶性疟原虫3D7的抑制试验

将3a～3f分别用DMSO溶解并制成10倍浓度梯度(1～105μmol·L-1)药液，采用RPMI 1640培养基稀释1 000倍(1～105nmol·L-1)。采取100%压积的新鲜红细胞(RBC)对恶性疟原虫3D7培养标本进行稀释，控制疟原虫感染率为0.3%～0.5%，并用RPMI 1640培养基将感染了恶性疟原虫的红细胞压积调至2%。 96孔测定板每孔加入20 μL含药培养液和80 μL恶性疟原虫3D7培养物，分别设置阴性对照组(20 μL含0.1% DMSO的培养基和80 μL 压积为2%且疟原虫感染率为0.3%～0.5%的红细胞)和阳性对照组(20 μL相应浓度梯度的ART DMSO溶液和80 μL压积为2%且疟原虫感染率为0.3%～0.5%的红细胞)，每种胆碱衍生物设6个浓度，每个浓度设3个复孔，每组试验进行3次。用SYBR GreenⅠ微量荧光法[10-11]测定3a～3f对疟原虫增殖的抑制作用，并计算其半数抑制浓度(IC50)。

2 结果与讨论

2.1 合成与表征

在3a～3f的合成中，与溴代正丁烷不同，溴乙烷和溴代正丙烷均为对温度和光线极为敏感的小分子烷烃，易挥发，故以这两种溴代烷烃为原料合成胆碱衍生物时，溴乙烷室温避光，溴代正丙烷于60 ℃避光，且反应时间应适当延长(约48 h)。

3a～3f属于离子型的化合物，与初始原料叔胺相比，水溶性增大，故选择丙酮作溶剂进行重结晶，以除去未反应完全的叔胺。旋蒸除去溶剂得黏稠状液体，溶解于35 mL丙酮中，适当加热使其完全溶解，搅拌均匀，冷却至室温，于-20 ℃静置2 h得目标化合物的白色针状晶体。

考虑到长链烷烃的空间位阻效应可能导致胆碱衍生物不能很好的被DCC识别，故本试验合成6种短链小分子季铵盐型胆碱衍生物3a～3f，它们均具有良好的溶解性，易溶于乙醇和水等溶剂。该反应条件温和，操作简单，环境污染小，且各胆碱衍生物产率均大于70%，纯度大于80%。

UV-Vis测定结果表明:3a～3f的最大吸收波长从408 nm红移至485 nm，证明了3a～3f中季铵离子的存在。

3a～3f的HR-MS分析结果显示其精确质量分数[M-Br]+(m/z)实测值与理论值误差值均小于5×10-6，且不饱和度、元素组成等均与其结构式相符，说明3a～3f为Scheme 1预期产物。

2.2 体外抗疟活性

3a～3f对疟原虫增殖的IC50分别为5.74±1.54, 732±45.9, 529±38.1, 385±27.3, 369±29.6, 318±21和68.1±6.5 nmol·L-1。采用两独立样本T检验将3a～3f的IC50与对照组进行比较，结果发现3a～3f的IC50与阳性对照组相比均不同程度的升高(P<0.05)。不同浓度的短链烷烃取代胆碱衍生物作用72 h后对恶性疟原虫3D7的抑制作用与阴性对照组相比均升高(P<0.05)。各浓度的短链烷烃取代胆碱衍生物对3D7的抑制作用均随浓度的增加而增强，表现出不同程度的剂量依赖性。3a～3f对3D7增殖的平均抑制率变化趋势见图1。

浓度/nmol·L-1

研究结果表明：3a～3f对恶性疟原虫3D4的增殖均具有不同程度的抑制作用，且对疟原虫增殖的抑制率随剂量的增高而不同程度地增强。比较IC50发现，3d～3f对恶性疟原虫3D7增殖的抑制作用较强，这可能是由于N+上取代基为乙基时，更容易被恶性疟原虫感染红细胞上ECCs识别而摄取。在一定范围内，随着R3碳链长度增加，目标化合物对恶性疟原虫3D7增殖的抑制作用逐渐增强，可能是由于碳链加长，化合物脂溶性增加，与疟原虫感染的红细胞细胞膜的作用增强。因此，该研究结果为季铵盐型胆碱衍生物抗疟活性构效关系的深入研究以及通过结构改造合成具有更高抗疟活性的季铵盐型胆碱衍生物提供了一定的试验基础。

3 结论

以N,N-二甲基乙醇胺和N,N-二乙基乙醇胺为初始原料合成了6种新型季铵盐型胆碱衍生物(3a～3f)。初步抗疟活性考察结果表明：3a～3f对恶性疟原虫3D7的增殖均具有一定的抑制作用，其中(1-羟基)二乙基正丁基溴化铵(3f)的抑制作用最为突出，推测其抗疟活性可能与N+上的取代基类型有关，进一步的结构优化和深入研究有待进行。

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Synthesis of Novel Choline Derivatives and TheirinvitroAntimalarial Activities

WANG Fang, ZHAO Qing, CHEN Hui-fang, ZHANG Shu-qiu*

(College of Pharmacy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,China)

Six novel choline derivatives of quaternary ammonium salts(3a～3f) were synthesized by reaction ofN,N-dimethyl ethanolamine orN,N-diethyl ethanolamine with brominated alkanes of different carbon chain length under reflux condition. The structures were characterized by UV-Vis，1H NMR and HR-MS. The antimalarial activities test showed that 3a～3f demonstrated different degrees of inhibiting effect on the growth ofplasmodiumfalciparum3D7invitro, and (1-hydroxy) diethyln-butyl ammonium bromide(3f) exhibited the strongest antimalarial activity with IC50of (68.1±6.5) nmol·L-1, but lower than Artemisinin[IC50(5.7±1.54) nmol·L-1].

ethanolamine; brominated alkane; quaternary ammonium salt; choline derivative;invitroantimalarial activity

2015-12-28

国家自然科学基金资助项目(81373364)

王芳(1990-)，女，汉族，山西吕梁人，硕士研究生，主要从事新剂型与药代动力学研究。 E-mail: 466049469@qq.com

张淑秋，博士，教授， Tel. 0351-4690955, E-mail: shuqiu.zhang@126.com

O623.73

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.04.15415