非洲凤仙茎基腐病病原学及药剂敏感性1)

2016-05-06孙慧颖陈悦周默边雪韩双白庆荣

东北林业大学学报 2016年3期

关键词：生物学特性

孙慧颖　陈悦　周默　边雪　韩双　白庆荣

(吉林农业大学,长春,130118)

非洲凤仙茎基腐病病原学及药剂敏感性1)

孙慧颖陈悦周默边雪韩双白庆荣

(吉林农业大学,长春,130118)

摘要对非洲凤仙(Impatiens wallerana Hook. f.)茎基腐病的症状进行了描述，结合病原形态特征、培养特性及rDNA-ITS序列分析结果，确定该病害由Rhizoctonia solani Kühn AG4-HG-Ⅰ融合群引起。病菌的生物学特性研究表明：菌丝较适生长温度为25～30 ℃；菌丝生长较佳的培养基为OA和PSA，较佳的碳源为D-(+)麦芽糖、α-乳糖和可溶性淀粉，较佳的氮源为硝酸钾和硝酸钠；pH=7时菌丝生长最好；光照条件对菌丝生长无影响；菌丝致死条件为51 ℃、10 min。采用生长速率法测定了病菌对30种杀菌剂的敏感性，结果表明，病菌对≥300亿个·g(-1)内生芽孢杆菌WP、1 000亿个·g(-1)枯草芽孢杆菌WP、25%肟菌·50%戊唑醇WG、40%氟硅唑EC敏感性较高，对其EC(50)<1.0 mg·L(-1)，可以作为田间防治非洲凤仙茎基腐病的首选杀菌剂。

关键词非洲凤仙；茎基腐病；病原鉴定；生物学特性；药剂敏感性

分类号S432.1；S681.1

Pathogen Identification and Fungicides Susceptibility onImpatienswallerianaRoot and Stem Rot

Sun Huiying, Chen Yue, Zhou Mo, Bian Xue, Han Shuang, Bai Qingrong

(Jilin Agricultural University, Changchun 130118, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(3)：101-105.

We described the symptoms ofImpatienswallerianaroot and stem rot disease. Based on the morphology, cultural characteristics of the isolates and ITS sequence, we identified the pathogen asRhizoctoniasolaniKühn AG4-HG-I. The results of the biological characteristics of the pathogen showed that the suitable temperature for mycelial growth was 25 ℃-30 ℃. The optimal media for mycelial growth were OA and PSA. D-(+) Maltobiose, α-lactose，soluble starch, potassium nitrate and sodium nitrate were optimal for mycelial growth. The pH of 7 was suitable for mycelial growth. Light had no effect on mycelial growth. The lethal temperature of mycelial was 51 ℃ for 10 min. The susceptibility of the pathogen to 30 fungicides was detected by mycelial growth rate method. The pathogen was more sensitive to Endophytic Bacillus WP, Bacillus Subtilis WP, Trifloxystrobin·Tebuconazole 25%·50% WG, Flusilazole 40% EC, EC50<1.0 mg/L.

KeywordsImpatiens walleriana; Root and stem rot; Pathogen identification; Biological characteristics; Laboratory toxicity

非洲凤仙(ImpatienswalleranaHook. f.)为凤仙花科(Balsaminaceae)，凤仙花属(Impatiens)植物,俗名苏丹凤仙花、玻璃翠，为多年生肉质草本植物,是草花中最耐阴的品种之一，适合于凉台、室内盆栽，也可做成吊盆等挂于窗前、树上或用于树荫下的绿化材料[1-3]。非洲凤仙原产非洲东部热带地区,凤仙花属主要分布于热带非洲、印度、西南亚、中国南部和日本的大部分地区[4]。非洲凤仙在北方地区多用作1年生栽培应用[5]。目前，在我国北京植物园热带温室[2]以及沈阳[5]、哈尔滨[6]等地均有栽培。2013年2月，在长春市春莲花卉基地非洲凤仙育苗圃发现茎基腐病，发病率高达45%，对非洲凤仙的生产造成严重危害；栽植后的植株也常常发生该病害，造成缺蔸死丛，影响其观赏价值。本研究对该病害的症状进行了描述，对病原菌进行了分离与鉴定，并对病原菌的生物学特性及药剂敏感性进行了研究，以期为该病害的诊断提供依据，为病害防控奠定基础。

1材料与方法

1.1病害标本的采集及症状观察

2013年2月中旬开始，在长春市春莲花卉基地进行病害标本采集，并跟踪调查，记录病害发生特点及危害情况。

1.2病原菌的分离、纯化与致病性测定

采用组织分离法对采自春莲花卉基地的病害标本进行病原菌的分离。剪取病健交界处的病组织若干块，大小为2 mm×2 mm，70%酒精消毒1 min，0.1%升汞消毒1 min。无菌水冲洗3次，置于PDA平板培养基上，每皿2～4块，在培养箱内25 ℃恒温培养。用灭菌的挑针，挑取单丝顶端2～3 mm，转入PDA培养基上置于恒温箱中25 ℃纯化培养。

1年生盆栽健康植株茎基部用75%的酒精消毒，将培养3 d的纯化菌株，打取直径8 mm的菌饼贴到已消毒植株的茎基部，每个分离物接种5盆，以接种无菌PDA为对照，分别套袋保湿培养，定期观察并记录植株的发病情况。

1.3病原菌的培养学性状及形态学观察

观察病原菌在培养基上的生长情况，菌丝、菌落及菌核的形态、色泽等。

细胞核染色：番红O-KOH染色法[7]。将灭菌的载玻片放入PDA平板中，挑取菌丝块放入平板中，置于培养箱中25 ℃恒温培养。待其菌丝长至载玻片1/3处，取出载玻片，放入含有番红O-KOH染色缸中，染色1 min，在超景深显微镜下进行观察，并拍照记录。

1.4病原菌的分子生物学鉴定

以CTAB法[8]提取的菌株基因组DNA为模板，ITS4/ITS5(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)/(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)为引物进行PCR扩增，扩增的产物送至上海生物工程有限公司进行测序，并将测序所得的rDNA-ITS序列递交GenBank，并与GenBank中核酸数据(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的ITS区相关序列进行同源性比较。

1.5病原菌生物学特性测定

供试菌株：FF1。

培养基对病原菌菌丝生长的影响：在PDA、PSA、PCA、OA、水琼脂、玉米粉、黄瓜煎汁培养基上分别放置直径为8 mm的病原菌菌饼，4次重复，25 ℃恒温培养，2 d后，采用十字交叉法测量菌落直径[9]。将培养3 d的病原菌菌饼(直径8 mm)，转入灭菌的150 mL对应的上述液体培养基中，置于25 ℃、180 r·min-1的恒温震荡培养箱中培养6 d。用真空抽滤机将菌丝分离后置于电热恒温鼓风干燥箱内，40 ℃烘干至恒质量，测其质量。

碳、氮源对病原菌菌丝生长和菌丝干质量的影响：①碳源。以查氏培养基为基础培养基[10]，分别称取等质量碳素的D(+)-麦芽糖、葡萄糖、D-果糖、α-乳糖、D-木糖、可溶性淀粉替代蔗糖，配置成培养基。移植菌饼(直径8 mm)到上述平板培养基中(15 mL·皿-1)，4次重复，25 ℃培养。2 d后，十字交叉法测量菌落直径。液体培养，6 d后，测量菌丝干质量。②氮源。以查氏培养基为基础培养基，分别称取等质量氮素的草酸氨、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、DL-α-丙氨酸、硝酸钠、硝酸氨氮源代替硝酸钾，配置成培养基，移植菌饼(直径8 mm)到上述平板培养基中(15 mL·皿-1)，4次重复，25 ℃培养。2 d后，十字交叉法测量菌落直径。液体培养，6 d后，测量菌丝干质量。

pH对病原菌菌丝生长的影响：用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH调节PDA培养基的pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，向上述不同pH平板(15 mL·皿-1)中移入菌饼(直径8 mm)，4次重复，25 ℃恒温培养。2 d后，十字交叉法测量菌落直径。液体培养，6 d后，测量菌丝干质量。

温度对病原菌菌丝生长的影响：将直径为8 mm的菌饼放置于PDA培养基平板中(15 mL·皿-1)，分别置于4、10、15、20、25、30、35、40、45 ℃下培养，4次重复。2 d后，十字交叉法测量菌落直径。

光照对病原菌菌丝生长的影响：将直径为8 mm的菌饼放置到PDA培养基平板(15 mL·皿-1)中，设置连续光照、光暗交替和完全黑暗3个处理，每个处理4次重复，25 ℃恒温培养，2 d后，十字交叉法测量菌落直径。液体培养，6 d后，测量菌丝干质量。

病原菌菌丝的致死温度测定：将培养3 d的病原菌(试管)，分别放置到30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃的水浴锅中处理10 min(预热1 min)。水浴后立即放入冷水中降至室温，将试管内菌丝转入PDA平板中，置25 ℃恒温培养，4次重复，3 d后根据其是否萌发确定菌丝致死范围。然后以1 ℃为梯度更精准的确定其致死温度[11]。

1.6室内药剂筛选

1.6.1供试菌株及药剂

供试菌株为FF1。试验选用化学农药和生物农药共计30种。供试药剂分别为：50%腐霉利WP(日本住友化学株式会社)；2%春雷·45%王铜WP(北兴化学工业株式会社)；40%菌核净WP、50%异菌脲WP(江西禾益化工有限公司)；10%甲霜·48%锰锌WP(深圳诺普信农化股份有限公司)；50%腐霉利WP(宜宾川安高科农药有限责任公司)；50%多菌灵WP(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)；75%百菌清WP、10%苯醚甲环唑WG(先正达作物保护有限公司)；10%多抗霉素WP(绩溪农华生物科技有限公司)；25%肟菌·50%戊唑醇WG(拜耳作物科学公司)；70%甲基硫菌灵WP(江苏龙灯化学有限公司)；77%氢氧化铜WP(浙江禾本农药化学有限公司)；30%醚菌酯WP(山东京博农化有限公司)；2.1%丁香·芹酚AS(大连永丰农药厂)；40%氟硅唑EC(陕西恒润化学工业有限公司)；66.5%霜霉威AS(重庆市化工研究院)；26%甲霜·6%噁霉灵AS(南京源生化工股份有限公司)；5%唑醚·55%代森联WG、25%吡唑醚菌酯EC(巴斯夫(中国)有限公司)；12.5%硅唑·27.5%多菌灵SE(陕西恒润化学工业有限公司)；30%噁霉灵AS(潍坊天达植保有限公司)；70%代森锰锌WP(利民化工股份有限公司)；30%氟菌唑WP(中农住商(天津)农用化学有限公司)；50%嘧菌环胺WG(陕西上格之路生物科学有限公司)；1 000亿个·g-1枯草芽孢杆菌(依天得)WP(武汉天惠生物工程有限公司)；2亿个·g-1木霉菌WG(云南星耀生物制品有限公司)；2亿菌落·g-1哈茨木霉菌WP(美国拜沃股份有限公司)；≥300亿个·g-1内生芽孢杆菌(益微)WP(山东京青农业科技有限公司)；0.1亿菌落·g-1多粘类芽孢杆菌FG(浙江省桐庐汇丰生物化工有限公司)。

1.6.2试验方法

将每种药剂配制成质量浓度分别为1×103、1×102、1×10、1、1×10-1、1×10-2mg·L-1的含药平板。取直径为8 mm的菌饼，放置于含药平板中央，菌丝面朝下，以不加药剂作为空白对照，每个处理3次重复。恒温培养箱中25 ℃培养2 d后，采用十字交叉法测量供试病菌在含药培养基上的菌落直径，与对照比较计算各药剂处理对病菌的生长抑制率。查机率值与死亡率(抑制率)换算表，用最小二乘法建立毒力回归方程，计算出各药剂对病原菌的有效中浓度(EC50)，比较病原菌对各种药剂的敏感程度。

抑制率=((对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼原始直径))×100%。

2结果与分析

2.1病害症状

该病害主要为害非洲凤仙幼苗的茎基部，在靠近地面的茎基部形成椭圆形或不规则的暗褐色病斑，略凹陷，水渍状，病斑逐渐向茎基部周围扩展，形成绕茎病斑，病部溢缩，最后叶片萎蔫枯死。当病斑绕茎一周后，幼苗逐渐枯死。潮湿时，病苗基部可见浅褐色的蛛丝网状霉。

2.2病原菌的分离、纯化与致病性

通过组织分离和单丝分离获得培养性状一致的9个分离物，分别命名为FF1、FF2、FF3、FF4、FF5、FF6、FF7、FF8、FF9。致病性测定结果表明：接种后5～7 d后表现的发病症状与田间观察到的症状一致，对照植株未见异常(部分接种结果见图1)。对发病部位进行病菌的再分离，得到与原来培养性状一致的分离物，证明菌株FF1～FF9均具有致病力，为该病害的病原菌。

2.3病原菌的培养性状及形态

菌株FF1～FF9形态特征一致，在PDA培养基上菌丝均匍匐生长，气生菌丝少，菌丝呈放射状。菌丝直径5.54～11.48 μm，菌丝细胞多核；多为直角分枝，分枝处稍有缢缩，近分枝处有1个隔膜，不产生菌核(图2)。菌落初期为灰白色或淡黄色，随培养时间的延长，最后全菌落变为褐色。根据病原菌的培养性状和形态特征，可鉴定该病原菌为茄立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)[12]。

A.EF1菌株接种植物发病症状及对照CK；B.EF9菌株接种植物发病症状及对照CK。

图1非洲凤仙茎基腐病菌的致病性测定结果

A.菌落形态；B、C.菌丝特征及细胞核染色。

2.4病原菌分子生物学鉴定

利用真菌特异性引物ITS4/ITS5对菌株FF1、FF7、FF9的rDNA-ITS进行PCR扩增，电泳检测结果得到大小约750 bp的片段。病原菌rDNA-ITS区序列PCR产物经生物公司测序为735 bp的核苷酸序列，GenBank登录号分别为HG934415、HG934416、HG934417。获得的序列与GenBank中已有的序列进行Blast分析，与RhizoctoniasolaniAG4-HG-I(DQ102447、AB000007、JN254788、KF746162)的序列同源性为99%，表明分离获得的病菌为RhizoctoniasolaniAG4-HG-I融合群。

2.5病原菌生物学测定

2.5.1不同培养基对病原菌生长的影响

由表1可知，非洲凤仙茎基腐病菌在7种培养基中均能生长，在OA培养基中生长最快，在水琼脂培养中生长较慢，在5%显著水平上存在显著性差异。菌丝在PDA中生长量最大，在水琼脂中生长量最小。