曹翠玲,张玖玲,杨向娜,邵　阳

(1 西北农林科技大学 生命科学学院,陕西杨陵 712100;2 深圳华大基因研究院,广东深圳 518083)



金银花根系VAM真菌侵染过程观察

曹翠玲1,张玖玲2,杨向娜1,邵阳1

(1 西北农林科技大学 生命科学学院,陕西杨陵 712100;2 深圳华大基因研究院,广东深圳 518083)

摘要:在金银花生长季节,从西北农林科技大学北校区药用植物园采集金银花根系及根际土壤,采用形态学方法观察研究了VAM真菌侵染其根系的过程,并对其孢子进行了初步的形态学分类。结果表明:(1)VAM真菌侵染金银花根系时,先形成附着胞,然后入侵到皮层细胞,在根内形成线性菌丝、圈状菌丝;菌丝末端产生泡囊;在较粗的菌丝上产生丛枝状菌丝,而且VAM胞内菌丝主干可以穿越相邻的2个皮层细胞,在皮层中连续形成丛枝;VAM菌丝形成丛枝时,首先是胞内菌丝上膨大产生乳状突起,而后在乳状突起上产生较粗的丛枝柄,最后在这些丛枝柄上产生极细的丛枝状菌丝形成成熟的丛枝结构。(2)VAM真菌菌丝在金银花皮层细胞中,有伸展状态、菌丝圈及丛枝状态,所以金银花与VAM真菌形成的菌根是混合型菌根。(3)金银花根际土壤中至少存在3种类型的VAM真菌孢子,因此认为金银花至少可与3种VAM真菌共生。(4)金银花种植地土壤有效磷含量(6.6 mg/kg)显著高于对照空地土壤有效磷含量(3.5 mg/kg);金银花生长旺盛季(4月下旬到5月中旬)VAM真菌对其根系的侵染率高达81%。

关键词:金银花根系;VAM真菌;侵染过程

金银花(Lonicerajaponica)是著名清热解毒的良药。金银花性甘寒,功能清热解毒、消炎退肿,对细菌性痢疾和各种化脓性疾病都有效。已生产的金银花制剂有“银翘解毒片”、“银黄片”、“银黄注射液”等。“金银花露”是用蒸馏法提取的金银花芳香性挥发油及水溶性溜出物,为清火解毒的良品,可治小儿胎毒、疮疖、发热口喝等症;暑季用以代茶,能治温热痧痘、血痢等。茎藤称“忍冬藤”,也供药用[1];同时,由于金银花耐荫,且是灌木状,还可以用来做绿化矮墙,亦可以利用其缠绕能力制作花廊、花架、花栏、花柱以及缠绕假山石等等[2]。

早在1900年,人们就在土壤中发现了与农业生产关系最为密切、分布最广的一种内生菌根真菌即丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)。AMF是广泛分布于土壤中的一类微生物,由于其菌丝体能侵入到宿主植物组织细胞内部,在根部皮层细胞内产生“泡囊”和“丛枝”两大典型结构,所以俗称为泡囊-丛枝菌根(vesicular-arbuscular mycorrhiza,VAM)[3]。VAM真菌是一类能够与大多数植物形成共生关系的真菌,与许多植物共生形成菌根后,显著促进植物对磷元素的吸收,进而促进植物的生长发育及产量[4],如VAM真菌侵染马铃薯根系后,马铃薯产量显著提高[5];黄花蒿接种摩西球囊霉后,N、P、K的吸收明显增加,净光合速率提高,植株茎、小枝和叶中的青蒿素含量明显提高[6]。因此与VAM真菌共生的植物矿质营养、生理活性得以改变,提高了植物的生理代谢活性[7-10]。

国外一直都十分重视对AM真菌种质资源、分布特征、生物多样性及其生态功能的研究[11-15]。中国近年来在该领域也开展了大量工作[16-17]。了解VAM真菌与植物互生关系,对开发利用VAM真菌有及其重要的意义。目前有学者研究了丹参、牡丹[18-19]等植物根围的VAM真菌多样性,但关于金银花根围VAM多样性及VAM真菌侵染其根系过程的观察研究未见报道。笔者调查了在自然条件下,VAM真菌侵染金银花根系的过程,以期了解并丰富中国药用植物金银花与VAM真菌互生关系的理论知识,丰富VAM生活史的内容，以期为利用菌根真菌提高药用植物生长提供理论依据。

1材料和方法

1.1样地概况

1.2样品采集

2012年3月至5月陆续取样。每次取样均随机选定10年生金银花3株。取土时先除去金银花根围3 cm厚的表层土,而后挖取10 cm×10 cm×10 cm的土样(其中有金银花的根系),迅速装入自封袋后拿回实验室。然后选直径0.5 mm左右的根系,将附在根上的土壤轻轻抖落于无菌自封袋中,用自来水清洗根系,而后用FAA固定根段24 h,用于观察VAM真菌侵染状况;将剩下的根系和附近根际土在无菌自封袋中轻轻抖动约1 min,风干并保存,用于测定土壤有效磷含量和pH值。或采取根际土壤,用于提取孢子。

1.3测定项目及方法

1.3.1菌根侵染过程观察不同时间取回的根系,均采用Christopher[20]的方法。先将植物细根剪下，在FAA中固定过夜;然后在5% KOH溶液中加热(略低于沸点)120 min,洗去碱液后用0.1 mol·L-1盐酸软化1 min,倒去酸液后放进0.1%甲烯蓝溶液中染色90 min。染色完成后以甘油为浮载剂将细根做成临时装片。用Olympus BX53显微镜观察,并用Image-Pro Plus软件进行观察拍照。

1.3.2菌根侵染率的调查和计算方法细根染色、分色后在显微镜下观察VAM真菌侵染情况。按0%、10%、20%、30%……100%的侵染数量计算出每条根段的侵染率[17],并记录。依下列公式计算该样品的菌根侵染率:

侵染率={Σ(0%×根段数+10%×根段数+20%×根段数+AA+100%×根段数)}÷观察总根段数

1.3.3金银花根际土壤中孢子外形观察采用湿筛倾析法分离VAM真菌孢子,在Nikon SMZ25体视镜下观察记录孢子形态。

1.3.4土壤有效磷含量测定用钼锑抗法[21]测定。

2结果与分析

2.1VAM真菌对土壤有效磷的影响

通过重复测定10 cm深度金银花采样地土壤和同等条件下空地土壤,结果显示,金银花采样地土壤有效磷含量为6.6 mg/kg;同等条件下空地土壤有效磷含量为3.5 mg/kg。二者之间的差异显著(P<0.05)。这可能是由于金银花根围每年都有大量的落叶等有机物累积而造成的。但不论是金银花采样地还是空白地,土壤均属缺磷土壤。

2.2金银花根系VAM真菌侵染分析

VAM是植物根系和VAM真菌在适宜生态条件下的共生体,因此侵染率大小与土壤温度以及植物的生长状态有密切关系。图1显示,在金银花生长季节,随着时间的延续,菌根侵染率逐渐升高。从3月28日到4月26日,间隔29 d,菌根侵染率增加了5%;从4月26日到5月15日,间隔19 d,侵染率增长了28%。统计分析表明,3月28日与4月26日之间的浸染率差异不显著,而它们与5月份的浸染率差异达极显著水平(P<0.01)。这说明,VAM真菌侵染金银花根系的最佳时间是4月下旬到5月中旬。这可能是由于5月份土壤温度逐渐升高、根系生理代谢旺盛、根系分泌物增加,比较有利于VAM真菌生长。

2.3VAM真菌对金银花根系的侵染及其菌丝发育过程观察

2.3.1附着胞的形成附着胞是VAM真菌与植物建立共生体系过程中形态上发生的特异性变化,标志着该真菌成功识别到一个潜在的宿主植物上[22]。本试验观察到VAM真菌侵染金银花根时,孢子萌发形成的根外菌丝在金银花根表形成一个扁平的膨大结构,即附着胞,其上可见菌丝(图版Ⅰ,1)。附着胞发生的部位即为VAM侵入宿主的侵入点。一般来说附着胞出现4～5 h后,宿主根表皮细胞内细胞核会向侵入点处移动,并引导形成侵入结构(prepenetration apparatus,PPA)[23]。 附着胞形成后,VAM真菌在根皮层侧形成纤细的针状感染型菌丝,进而VAM真菌就在植物根的皮层细胞内伸展繁衍。

图1　不同月份的菌根侵染率

2.3.2根内菌丝VAM真菌菌丝在宿主根内有不同的形态,其菌根名称亦不同,菌丝在细胞内形成丛枝结构的,菌根结构类型为疆南星型;菌丝在细胞内呈菌丝圈的,其菌根结构类型为重楼型(简称P-型);细胞内存在大量胞间菌丝和孢内圈状菌丝的,菌根结构类型被称为中间型(简称I-型)[24-25]。本试验结果显示,在金银花根部,VAM真菌菌丝能形成大量的丛枝结构(图版Ⅰ,2～6),同时菌丝又以菌丝圈(图版Ⅰ,7、8)形式存在。同时结果还表明,金银花根内菌丝还有大量的胞间菌丝(图版Ⅰ,7)。但金银花根内大量的P型菌丝主要分布在近中柱的皮层处,此处细胞大且排列疏松,菌丝侵入细胞后在细胞内卷曲、紧贴细胞壁生长一圈至两圈后,在原来进入细胞的部位再伸出细胞而进入相邻细胞,再形成菌丝圈;还可以看到,形成菌丝圈的菌丝上有不规则膨大,似乎呈串珠状(图版Ⅰ,8)。由此看来,金银花与VAM真菌形成的菌根是混合型菌根。Cavagnaroetal[26]认为VAM结构类型主要由宿主植物本身的特性(根系皮层细胞壁的结构和细胞间隙的大小)所决定。

2.3.3丛枝结构丛枝是菌丝在皮层细胞内形成的杂乱无章的菌丝结构即吸器结构。1905年Gallaud因这种结构很像细小的树枝将其命名为Arbuscular(来自于拉丁文arbusculum,意思是灌丛或者小乔木)[27]。丛枝的功能主要是吸收和释放养分。因此丛枝是真菌与宿主植物细胞间进行物质交换的结构。本试验结果显示,与金银花根系共生的VAM真菌在皮层细胞内能形成大量的丛枝结构(图版Ⅰ,2 ),而且丛枝似乎是菌丝生长到一定时间后,在多个皮层细胞中同时发生(图版Ⅰ,3)。因此推测,VAM真菌侵入金银花根皮层细胞后,可能是随着根延伸生长,菌丝一边在多个皮层细胞延伸生长,一边在较粗的菌丝上形成丛枝。当VAM菌丝形成丛枝时,首先在胞内菌丝上膨大产生一个乳突状结构(图版Ⅰ,4),在其上再产生较粗的丛枝柄,然后在这些丛枝柄上产生极细的丛枝菌丝形成成熟的丛枝结构(图版Ⅰ,5、6)。整体来看,金银花根皮层细胞内,VAM真菌形成丛枝,分枝似鹿角,主干菌丝(直径5～10 μm)上再产生2～3级的分枝,有些二级分枝膨大,呈乳突状,其直径超过了菌丝,然后在其上产生向周围伸出的细小丛枝结构(直径小于1 μm；图版Ⅰ,4～6)。同时作者还观察到,金银花根中的VAM胞内菌丝主干可以穿越相邻的2个皮层细胞,连续形成丛枝(图版Ⅰ,5)。

2.3.4泡囊泡囊是菌丝膨大而形成的结构。在丛枝出现后泡囊即开始生长,但在丛枝普遍退化后泡囊仍继续生长发育直至成熟。泡囊中有脂肪和细胞质,所以被认为是重要的营养物质储藏器官[28]。本试验观察结果显示,在金银花根中,有正在发育的泡囊(图版Ⅰ,9),发育成熟的泡囊充满了所在的皮层细胞(图版Ⅰ,10),其形状相似于所在的皮层细胞形状,多是单独存在(图版Ⅰ,11)。

本试验观察到,泡囊似乎可聚集发生(图版Ⅰ,12),似乎是菌丝在不同的皮层细胞中可以连续膨大而形成囊泡。金银花根中的泡囊,还可以出泡形成泡囊(图版Ⅰ,13),这与Abbott[29]的结果相似。

2.4金银花根际的VA真菌的孢子形态

孢子是VAM的繁殖体。通常具有多层细胞壁,内部含有细胞质以及多个核。有研究表明,在陕西农田中,主要分布的有Glomusmosseae、G.aggregatum、G.caledonium、G.geosporum、G.versiforme、G.dimorpicum和G.constrictum[30]这几个种。其中Glomusmosseae和G.aggregatum出现机率较大。本研究观察结果显示,在金银花根际存在3种颜色的VAM真菌孢子(图版Ⅰ,14、15):黑色、棕色和黄色孢子。其中黑色孢子直径为190～250 μm,棕色直径是286 μm,黄色孢子的直径是210～267 μm。这个结果说明,在金银花根际,存在着VAM真菌多样性,也就是说,金银花同时可以和多种VAM真菌共生,形成VAM。参照Schenck等[31]的“VAM真菌鉴定手册”以及刘润进等[17]的分类标准,初步判定这几种VAM真菌可能都属于球囊霉目。到底是哪种,尚需做进一步的分子鉴定。

3讨论

在自然状况下,一种宿主植物根际土壤中通常生活着几种VAM真菌[32-33],它们与植物形成了共生关系,植物为VAM真菌提供了一个安全的生态位,并为其提供生长繁殖所需的碳水化合物,而真菌则帮助植物增强对磷、锌、铜等矿质元素和水分的吸收,并增强植物的抗逆性,竞争能力等。Mosse认为任何一种VAM真菌均可以感染任意一种植物形成VAM菌根,即VAM真菌与宿主植物之间无专一性[34]。但李涛等[35]研究结果显示,不同宿主植物根际能容纳VAM真菌的种群数以及各种群数量明显不同,即不同植物根际土壤中VAM真菌种群的组成和数量是有区别的,也就是说虽然VAM真菌对宿主植物不存在专一性,但宿主植物对VAM真菌却有选择。本试验支持后者的观点。

侵染率是表征根系菌根化程度高低的常用指标。刘永俊等[36]指出,AMF总侵染率的最高和最低值分别出现在柠条的生长初期(4月)和末期(10月);AMF侵染率和土壤孢子密度具有显著的季节性变化,宿主植物根系内的AMF群落组成也有季节性差异[36]。这是因为AMF的季节性主要受宿主植物物候关系的影响[37-39]。本试验样地地处关中平原,实验进行时间也是3月到5月,在此期间,关中地区温度逐渐升高、光照时间逐渐延长、降水量逐渐上升,恰是金银花旺盛生长阶段,因此在3～5月份,VAM真菌侵染率呈升高趋势。这充分说明VAM真菌侵染植物根系,除与植物类型有关外,还与外界环境条件密切相关:温度越低,光照强度越弱、植物生长越缓慢,VAM真菌生长发育就越迟缓。在自然界中,VAM真菌可能与寄主植物的生长发育进程是同步的[40]。

但是关于金银花中VAM真菌孢子详细发育过程,作者还未观察到。本研究拟进一步观察研究孢子发育的详细过程，以期丰富金银花VA真菌的理论知识库。

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图版说明:

图版 Ⅰ1.根表面的附着胞;2.皮层细胞VAM真菌丛枝结构及其分布;3.皮层细胞VAM真菌丛枝同时发生;4.皮层细胞菌丝上的乳突状结构(红色箭头);5.VAM真菌粗大菌丝(箭头)穿过相邻细胞后再形成丛枝;6.皮层细胞中VAM成熟的丛枝结构;7.皮层细胞中线型(红色箭头)菌丝和圈状菌丝(黄色箭头);8.放大的圈状菌丝;9.正在发育的泡囊;10.皮层细胞中分布的泡囊;11.泡囊形状相似于所在皮层细胞形状;12.连续发生多个泡囊;13.泡囊分裂;14.3种颜色的成熟孢子;15.具有胞连丝的孢子皮层细胞VAM真菌丛枝结构放大图(箭头)。

Explanation of plate:

Plate ⅠFig.1.The prepenetration apparatus on theroot surface of honeysuckle;Fig.2.The distribution and structure of Arbuscules in the cortical cells;Fig.3.Took place of Arbuscules in the cortical cell at the same time;Fig.4.The mastoid structure of hyphae in the cortex cells(red arrow);Fig.5.The bulky hyphae(arrow) through the adjacent cell walls and then formed arbuscular arbscule stucture;Fig.6.The amplificaition of the structure of a arbuscule fromed in the cortex cells;Fig.7.The linear hyphae(red arrow) and hyphal coil (yellow arrow) in the cortex cells;Fig.8.Amplification of hyphal coil;Fig.9.Developing vesicle;Fig.10.The distribution of the vesicle in cortex;Fig.11.The vesicle shape was similar to the shape of the cortical cell,where the vesicle was located;Fig.12.Occurrence of vesicles consecutively;Fig.13.The split of vesicles;Fig.14.Three colors of mature spores;Fig.15.Yellow spore with hyphae.

(编辑:潘新社)

Investigation of the Mycorrhiza Forming in Honeysuckle Infected by Vesicular Arbuscular Mycorrhizal(VAM)

CAO Cuiling1,ZHANG Jiuling2,YANG Xiangna1,SHAO Yang1

(1 College of Life Science,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2 Shenzhen Huada Gene Research Institute of Guangdong,Shenzhen,Guangdong 518083,China)

Abstract:In this paper,authors investigated the forming process of VAM in the root of honeysuckle.Results showed that:(1)when honeysuckle’s root was infected by VAM fungi,appressorium appeared firstly in the root epidermis,and then hyphae invaded cortical cells.There were down with linear and looped hyphae to form finaly in the cortical cells.Vesicle appeared at the end of the hyphae;In the thick hyphae,very tiny and dense mycelium appeared.It looked like a crown that was the arbuscular.some coarser hyphae could pass through two neighboring cortical cells and formed arbuscular continuously.When VAM hyphae formed arbuscular,VAM hyphae inflated and formed a emulsion bumps and then grow out of a short and thick stalk hyphae,then wiched broom.(2)There were three VAM hyphae morphological types in honeysuckle cortex cells:the stretching,hyphal coils and arbscule;honeysuckle with VAM mycorrhiza should belong to mixed mycorrhizal.(3)There were at least three types of VAM fungi spores in the honeysuckler’s rhizosphere,so honeysuckle formed a symbiotic relationship with at least three kinds of VAM fungi.(4)Available phosphorus content of the soil planting honeysuckle was 6.6 mg/kg that was significantly higher than that of the no plant soil’s (3.5 mg/kg);Impregnation rate of the VAM was 81% in the vigorous growth season (late April to mid-May).

Key words:Honeysuckle rootsystem;VAM fungi;infection process

中图分类号:Q944.5

文献标志码:A

作者简介:曹翠玲(1960-),女,博士,教授,主要从事植物养分生理的研究。E-mail:cuilingcao@nwsuaf.edu.com

基金项目:陕西省科学技术研究发展计划(2013K01-38)

收稿日期:2015-12-31;修改稿收到日期:2016-02-29

文章编号:1000-4025(2016)03-0479-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0479