薛　彬，张　晴，郑占伟，祝仕清，孟雅娟

(华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心

河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄 050015)



HPLC法同时测定环孢素A和其衍生物的含量

薛彬，张晴，郑占伟，祝仕清，孟雅娟

(华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心

河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄 050015)

摘要：采用Diamonsil-C(18)色谱柱，柱温60 ℃下，以磷酸水-乙腈为流动相，流速1.0 mL·min(-1),检测波长210 nm，建立了同时测定发酵液中环孢素A和其衍生物的高效液相色谱(HPLC)检测方法。结果表明，在10～2 000 μg·mL(-1)浓度范围内，环孢素A和其衍生物的峰面积与浓度呈良好的线性关系，相关系数分别为1.0000和0.9999；按标准加入法计算回收率,环孢素A和其衍生物平均回收率分别为100.07%和100.06%；精密度实验的RSD值分别为0.97%和1.14%。该方法具有分析时间短、操作简便、结果准确、重现性好等特点。

关键词：环孢素A；环孢素A衍生物；液相色谱法；发酵液

环孢素A是一种环状的具有亲脂性的含8个氨基酸的多肽化合物，主要由雪白白僵菌、茄病镰刀菌和柱孢霉菌等霉菌经发酵得到[1]，被广泛用于治疗器官移植术后的排异反应、免疫系统特别是自身免疫系统疾病。近年来，也被用来治疗再生不良性贫血症和各类皮肤病[2]，并发挥了重大作用。随着研究的不断深入，人们发现在环孢素A发酵过程中有时会伴有环孢素A衍生物的产生，而这种衍生物经过一系列修饰后能够成为一种具有抑制HCV活性的抗病毒药物，同样具有极大的研究价值[3]。此外，由于环孢素A发酵液成分复杂，除了环孢素A和其衍生物外，还会伴有很多其它复杂成分存在，且样品数量多，因此，使用《中国药典》和其它文献方法[4-5]不能很好地对环孢素A、环孢素A衍生物和其它杂质进行分离，且分析时间较长。而高效液相色谱法(HPLC)对发酵液进行含量测定时能对各种成分很好地分离，且操作简便快捷。作者在此建立了一种能够同时测定环孢素A和其衍生物含量的HPLC法，拟为环孢素A和其衍生物的含量测定提供参考。

1实验

1．1试剂与仪器

环孢素A对照品(含量98.8%，批号：080523)、环孢素A衍生物对照品(含量98.3%，批号：081017)，自制。

乙腈，色谱纯，Honeywell公司；磷酸，分析纯，天津永大化学试剂有限公司；水为二次蒸馏水。

LC-2010A型高效液相色谱系统、SPD-MZOA型二级管阵列检测器，日本岛津公司；Heraeuspico21型离心机，Thermo公司；CP225D型电子天平(十万分之一)，Sartorius公司。

1．2方法

1．2.1色谱条件

采用二级管阵列检测器扫描环孢素A和其衍生物的紫外光谱，发现在210nm处环孢素A和其衍生物均有较大吸收，故检测波长选取210nm。实验表明，WatersSymmetry-C18色谱柱和Diamonsil-C18色谱柱均能对环孢素A、环孢素A衍生物和其它杂质进行很好的分离，综合考虑成本因素，选用Diamonsil-C18色谱柱。

Diamonsil-C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；

流动相：0.5‰磷酸水-乙腈(20∶80)；流速：1.0mL·min-1；检测波长：210nm；柱温：60 ℃；进样量：10μL。

在上述色谱条件下，环孢素A和其衍生物能够很好地分离，且杂质不干扰测定。

1．2.2溶液的配制

对照品溶液：称取环孢素A和其衍生物对照品各10mg，置于同一100mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液：取环孢素A发酵液原液，用无水乙醇稀释4倍，3 000r·min-1下离心20min，取上清液作为供试品溶液。

1．2.3样品含量的测定

分别取3批发酵液样品(批号分别为：0627、0628和0629)，按1.2.2方法配制成3批供试品溶液，并取对照品溶液1份，按1.2.1的色谱条件进行分析，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中环孢素A和其衍生物的含量。

2结果与讨论

2.1环孢素A和其衍生物对照品、环孢素A发酵液的HPLC图谱(图1)

图1　环孢素A和其衍生物对照品(a)、环孢素A发酵液(b)的HPLC图谱

2．2供试品的检测结果(表1)

表1

供试品的检测结果/(μg·mL-1)

Tab.1

Test results of samples/(μg·mL-1)

2.3线性关系考察

将环孢素A和其衍生物对照品分别配制成浓度(μg·mL-1)为2 000、1 000、300、200、100、50、10的溶液，按1.2.1的色谱条件进行分析，测定峰面积，以峰面积(y)为纵坐标，浓度(x)为横坐标，分别绘制标准曲线，并拟合得回归方程为：环孢素A：y=10 623x+803.68，R2=1.0000；环孢素A衍生物：y=11 740x+2 581.4，R2=0.9999。表明，在10～2 000 μg·mL-1浓度范围内，环孢素A和其衍生物的峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.4回收率实验

取12份已知浓度的供试品，其中6份精密加入环孢素A浓度为101.4 μg·mL-1的对照品溶液1 mL，另外6份精密加入环孢素A衍生物浓度为108.7μg·mL-1的对照品溶液1 mL，分别混匀后按1.2.1的色谱条件进行分析，计算回收率，结果见表2、表3。

表2

环孢素A回收率实验结果

Tab.2

Recovery test results of cyclosporine A

表3

环孢素A衍生物回收率实验结果

Tab.3

Recovery test results of cyclosporine A derivatives

由表2、表3可知，环孢素A和其衍生物平均回收率分别为100.07%和100.06%。

2.5稳定性实验

取1份供试品溶液，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h分别进样，测得环孢素A和其衍生物峰面积RSD分别为1.92%和1.87%。表明环孢素A发酵液在24 h内稳定性好。

2.6精密度实验

取环孢素A和其衍生物对照品分别配制成浓度约为100 μg·mL-1的溶液，再分别按1.2.1的色谱条件平行测定6次，测得环孢素A对照品峰面积的RSD为0.97%，环孢素A衍生物对照品峰面积的RSD为1.14%。表明方法的精密度较高。

2.7重复性实验

取同一批供试品(批号：0627)6份，按1.2.1的色谱条件分析，测得环孢素A和其衍生物平均含量分别为142.3 μg·mL-1和100.8 μg·mL-1，RSD分别为1.21%和1.02%。表明方法的重复性良好。

3结论

采用Diamonsil-C18色谱柱，柱温60 ℃下，以磷酸水-乙腈为流动相，流速1.0 mL·min-1，检测波长210 nm，建立了同时测定发酵液中环孢素A和环孢素A衍生物的HPLC法。结果表明，在10～2 000 μg·mL-1浓度范围内，环孢素A和其衍生物的峰面积与浓度呈良好的线性关系，相关系数分别为1.0000和0.9999；按标准加入法计算回收率，环孢素A和其衍生物平均回收率分别为100.07%和100.06%；精密度实验的RSD值分别为0.97%和1.14%。该方法具有分析时间短、操作简便、结果准确、重现性好等特点，特别适用于对环孢素A菌种的大量筛选。

参考文献：

[1]郑孝贤,邱观荣,唐信东,等.环孢菌素A高产菌株摇瓶发酵及菌丝体的形态变化[J].中国抗生素杂志,2009,34(2):97-99.

[2]郭平,李芚,廖工铁.环孢菌素临床药代动力学研究进展[J].中国药学杂志,1995,30(10):585-588.

[3]任凤芝,张雪霞,陈书红,等.环孢素衍生物(γ-hydroxylmethylleucine4)-cyclosporin A的分离纯化与鉴定[J].中国抗生素杂志,2013,38(7):512-515.

[4]耿艳辉,刘素彦,王素卿,等.高效液相色谱法测定环孢素A含量[J].理化检验：化学分册,2013,49(4):408-410.

[5]廖芸,沈友轩.高效液相色谱法测定环孢素A血药浓度[J].江西医学院学报,2009,49(5):54-58.

Simultaneous Determination of Cyclosporine A and Its Derivatives by HPLC

XUE Bin,ZHANG Qing,ZHENG Zhan-wei，ZHU Shi-qing，MENG Ya-juan

(HebeiIndustryMicrobialMetabolicEngineering&TechnologyResearchCenter,NationalEngineeringResearchCenterofMicrobialMedicine,NCPCNewDrugR&DCo.,Ltd.,Shijiazhuang050015,China)

Abstract：A simultaneous determination method of cyclosporine A and its derivatives in fermentation broth by HPLC was developed using Diamonsil-C(18) column at temperature of 60 ℃,phosphoric acid solution-acetonitrile as mobile phase with a flow rate of 1.0 mL·min(-1),and the detection wavelength of 210 nm.Results showed that,there was a good linear relationship between peak areas of cyclosporine A and its derivatives in the concentrations range of 10～2 000 μg·mL(-1),and the correlation coefficients were 1.0000 and 0.9999,respectively.The average recoveries for cyclosporine A and its derivatives were 100.07% and 100.06%，respectively,which were calculated by a standard addition method.The RSD values of precision experiment were 0.97% and 1.14%,respectively.This method is time-saving,convenient,accurate and reproducible.

Keywords：cyclosporine A;cyclosporine A derivatives;HPLC;fermentation broth

中图分类号：O 657.72

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)03-0068-03

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.018

作者简介：薛彬(1978-)，女，河北承德人，工程师，主要从事药物研发工作，E-mail：binbin197809@163.com；通讯作者：孟雅娟，高级工程师，E-mail：mengyajuan@163.com。

收稿日期：2015-11-25