杨解解，陈 鑫，李 涛，刘俊林

(西北民族大学 生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730030)

一株枸杞内生真菌16-3产橘黄色素的提取工艺及稳定性研究

杨解解，陈 鑫，李 涛，刘俊林*

(西北民族大学 生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730030)

药用植物内生菌有产生活性物质的潜力，是天然功能色素的潜在来源之一.文章从温度、pH、 光照、金属离子、氧化剂方面探究枸杞内生菌16-3所产橘黄色素的稳定性.结果表明，该菌所产橘黄色素在高低温、酸碱环境、氧化剂与紫外线条件下较为稳定，该色素在 pH2～11环境条件下色素稳定性高，且有增色效应.金属离子Ca2+、Na+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Ba2+对该色素有护色或增色作用，无明显不良影响.在氧化剂K2CrO7、NaClO 、FeCl3、浓H2SO4、浓HCl、浓HNO3、K2MnO4、H2O2对该色素具有护色或增色作用，无明显不良影响.

内生真菌;枸杞;橘黄色色素;稳定性

天然色素因其安全无毒, 并且具有特有的营养价值和生理活性, 深受人们喜爱[1].微生物色素作为一种从微生物中提取的天然色素不受资源、时间和空间的限制, 具有植物色素和动物色素不可比拟的优越性[2].本研究分离得到的一株枸杞内生真菌在发酵过程中能产生色泽鲜艳的橘黄色素.枸杞在治疗或调理免疫功能疾病和抗氧化、抗衰老、抗菌、抗癌、降血糖等方面有重要药用功能.其内生真菌在长期与之共同进化后，可能产生具有与药材枸杞活性物质功能相同或相似的物质[3]，所以用药用植物枸杞内生真菌产生的天然色素可能具有一定的药理功效.

天然色素一般稳定性较差，对光、热、金属离子、pH 等因素非常敏感，色价会随着环境条件的变化而发生改变[4],色素的稳定性决定了其应用范围，可见色素稳定性的研究具有非常重要的意义.本文以一株产橘黄色素枸杞内生菌 16-3为材料，对产生橘黄色素的稳定性进行初步探究，为该色素进一步开发利用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

枸杞内生真菌16-3，由西北民族大学生命科学与工程学院细胞与胚胎工程实验室、生化与生物制药实验室共同分离、保藏的中药材枸杞内生真菌菌株.

1.1.2 培养基

PDA 固体培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL、pH5.8.

1.2 实验方法

1.2.1 色素的提取

用接种环将分离纯化后的枸杞16-3内生真菌接种在PDA固体培养基上，28 ℃培养至培养基中色素含量饱和后，将菌丝与培养基分离.弃菌丝仅留含色素的培养基，将含色素的培养基破碎并浸泡在色素溶解剂中，料液比为：质量/体积=1/50，2 000 r/min振荡过夜后离心[1]，吸取上层色素清液，将色素溶液于25 ℃恒温干燥得干品色素，在4 ℃条件下保藏.

1.2.2 色素测试液配制

将干品色素溶于蒸馏水中，精确制成浓度为0.001 g/mL的色素测试液.

1.2.3 色素吸收光谱曲线的测定

取上述已经处理过的橘黄色素，以蒸馏水作为对照组，利用紫外分光光度计在波长为 300～850 nm 间进行吸光度测定，以10 nm为间隔进行扫描，并记录数据，分析得到λmax

1.2.4 温度对色素稳定性影响

取浓度为0.001 g/mL色素溶液，分别于4 ℃、 20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃恒温水浴条件下、黑暗环境中保温 1 h[5].将其迅速冷却至常温观察颜色变化，以蒸馏水为对照分别测定其在最大吸收波长处的吸光值，分析其在4～100 ℃温度范围内的稳定性.

1.2.5 pH对色素稳定性影响

取浓度为0.001 g/mL色素溶液，色素溶液与酸碱试剂以3︰1的比例，对照组色素溶液与蒸馏水以3︰1的比例，分别与pH 2、pH 3、pH 4、pH 5、pH 6、pH7、pH 8、pH 9、pH 10、pH 11的酸碱试剂充分混匀，静置1 h后于紫外分光光度计下分别测定其在最大吸收波长处的吸光值，分析比较其在各金属离子溶液中的稳定性.

1.2.6 金属离子对色素稳定性影响

取3 mL浓度为0.001 g/mL色素溶液，分别加入含有1 mL浓度为0.2 mg/mL含有Ca2+、Na+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Ba2+ +的金属离子水溶液(仅含一种金属离子),室温下在黑暗环境中静置1 h，观察溶液颜色变化，并于紫外分光光度计下测定其最大吸光值.分析比较其在各金属离子溶液中的稳定性.

1.2.7 氧化剂对色素的稳定性影响

取3 mL浓度为0.001 g/mL色素溶液，分别加入1 mL浓度为0.2 mg/mL的氧化剂K2CrO7、NaClO、FeCl3、浓H2SO4、浓HCl、浓HNO3、K2MnO4、H2O2中，室温下在黑暗环境中静置一小时，观察溶液颜色变化，并于紫外分光光度计下测定其最大吸光值，分析比较其在各氧化剂溶液中的稳定性.

2 结果与分析

2.1 产橘黄色素内生真菌菌株及色素提取液

图1 产橘黄色素枸杞内生真菌16-3 图2 枸杞内生真菌16-3橘黄色素提取液

2.2 色素特征吸收光谱曲线

图3为橘黄色素在300～850 nm 范围内用紫外分光光度计测试形成的图谱.该色素在可见光范围内有2个吸收峰，最大吸收峰为330 nm,其对应的最大吸光度值为1.244.

图3 色素特征吸收光谱曲线

2.3 温度对色素稳定性影响结果

如图4所示,该橘黄色素在4～100 ℃温度范围内能稳定存在.其在该温度范围内处理后，观察颜色无明显变化.再将其置于紫外分光光度计下测定其吸光值与原溶液对比，相差不大.

图4 温度对色素稳定性影响曲线图

2.4 pH对色素稳定性影响

如图5所示,该橘黄色素在pH2～11范围内能稳定存在.其在该pH范围内处理后，观察颜色无明显变化，再将其置于紫外分光光度计下测定其吸光值与原溶液作对比，相差不大.特别是在pH2～5与pH8～11时，色素出现明显增色效应，且无沉淀产生.说明该橘黄色素在一定酸碱环境下能稳定存在，便于应用，且该色素在酸性环境下的增色效应比碱性环境下明显.

图5 pH对色素稳定性影响曲线图

2.5 金属离子对色素稳定性影响结果

如图6所示，该橘黄色素在金属离子Ca2+、Na+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Ba2+环境条件下，能稳定存在.将该色素用浓度为0.2 mg/mL的这些金属离子处理后，观察颜色无明显变化.再将其置于紫外分光光度计下测定其吸光值与原溶液作对比，相差不大.其中Ba2+对该色素有明显增色作用.

图6 金属离子对色素稳定性影响

2.6 氧化剂对色素的稳定性影响结果

如图7所示，该橘黄色素在氧化剂K2CrO7、NaClO、FeCl3、浓H2SO4、浓HCl、浓HNO3、K2MnO4、H2O2环境下能稳定存在.将该色素用浓度为0.2 mg/mL的这些氧化剂处理后，观察颜色无明显变化.再将其置于紫外分光光度计下测定其吸光值与原溶液作对比，相差不大.其中K2CrO7、浓H2SO4对该色素有明显的增色作用.

图7 氧化剂对色素的稳定性影响

3 结论与展望

该色素为水溶性，便于提取分离.将枸杞内生真菌16-3于28 ℃下恒温培养3 d即可初步产生色素，培养至12 d色素即在颜色、产量、性能各方面达到最佳状态.这时就可以开始提取进行生产应用.实验表明，该橘黄色素在4～100 ℃温度范围内能稳定存在，在生产实践中对温度的限制小，在一定范围内不必担心因温度问题而造成色素品质下降.在pH2～11范围内能稳定存在,且在pH2～5与pH8～11时，色素出现明显增色效应.在生产实践中可适量加入硫酸化氢氧化钠以提高色素品质，使颜色更鲜艳.此种色素用于酸性饮料的生产，不仅可以增加色泽度，还可能存在一些枸杞中有效物质使饮料的潜在效用增加，但本实验未对该色素的安全性进行过详细严格的研究，如要用于食品生产中，需进一步检验其安全性[6].金属离子Ba2+、氧化剂 K2CrO7、浓H2SO4对该色素都有明显增色作用，在非食品应用的实际生产中可适量加入其中之一[7]，提高产品色泽.

本文所提取的橘黄色色素是中国传统药用植物枸杞的次生代谢物，其与枸杞长期共生可能产生与之具有相同或相似功能的药理活性物质，可用于抗氧化、抗衰老、抗菌等方面的保健品或药品的研究.该色素在理化性质、结构基础，食用安全上还有待于进一步的研究，以期为药品、化妆品、食品、保健品行业做出一定的贡献.

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[3] 陈立立,洪巧妹,邱敏,张建,陈海敏.一株银杏内生真菌红色素稳定性的研究[J].中国食品添加剂,2011,(3)：118-121.

[4] 许友姣，陆利霞，熊晓辉 . 提高天然食用色素稳定性技术研究进展 [J]. 食品研究与开发，2008，29(2)：188-192.

[5] 张立强,梁华兵,艾桃山,喻运珍,丁桂珍,张光华.一株产红色素真菌的鉴定及色素稳定性分析[J].湖北农业科学,2015,54(12):2863-2865.

[6] 赵东红,陆玲,秦怀兰.一种微生物发酵产蓝色素的稳定性及毒性研究[J].食品与发酵工业,1998,24(5)：21-25.

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2016-11-10

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杨解解(1997—), 女,湖南洪江人.

TS202.3

A

1009-2102(2016)04-0033-04