欧朝萍，吴汝娟，马咸莹,王冬梅

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2. 西北民族大学 实验中心，甘肃 兰州 730030)

产类胡萝卜素菌株的分离与鉴定

欧朝萍1，吴汝娟1，马咸莹1,王冬梅2*

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2. 西北民族大学 实验中心，甘肃 兰州 730030)

从植物落花土壤中分离筛选、纯化出产红色色素的菌株，以分离菌株为研究对象, 采用酸热破壁法处理发酵菌体细胞，丙酮浸提色素，紫外分光光度计测定浸提物最大吸收波长，确定菌株是否产类胡萝卜素.对目的菌株进行培养条件的优化及生理生化鉴定.从试样中分离纯化得到4株产色素菌株.仅J3菌株的丙酮浸提液的最大吸收波长在470 nm附近，确定该菌株代谢产物中含有类胡萝卜素.营养肉汤—无机盐复合培养基最适合其生长，类胡萝卜素产量约为3.873 mg/L.初步鉴定J3菌株为戈登氏(gordonia)菌属细菌.

产类胡萝卜素菌株；菌株分离；菌株鉴定

类胡萝卜素为40 碳的碳氢化合物(胡萝卜素)和它们的氧化衍生物(叶黄素)两大类色素的总称，在自然界中存在着600 多种类胡萝卜素，在微生物、植物、动物中广泛存在[1]，其中以β-胡萝卜素最为典型，作为维生素A 原的活性最强，被认为是人体获得必需的维生素A 的重要来源.在国内，β-胡萝卜素已作为安全着色剂列入中华人民共和国国家标准.β-胡萝卜素还作为一种营养强化剂，广泛添加到食品中[3].

利用微生物生产类胡萝卜素是获得生物资源型类胡萝卜素的最重要的途径[1-5].目前，已发现的产类胡萝卜素的菌株主要为光合细菌、霉菌、酵母和藻类.其中光和细菌需要光照，不适用发酵罐大量培养.霉菌中较为普遍的有三孢布拉霉菌，由于其丝状真菌的特点，导致其发酵调控工艺较为复杂.酵母如红酵母生产类胡萝卜素的产量相对较低.藻类由于受产地和季节的限制，而无法大规模推广.因此，有必要进一步发掘新的种属的类胡萝卜素生产菌株.本实验从植物落花土壤中筛选、分离纯化出产类胡萝卜素菌株，以丰富天然胡萝卜素的微生物资源.

1 材料与方法

1.1 菌种来源

从西北民族大学榆中校区的牡丹园、黑心葵园等处采集植物落花土壤试样4份.方法：五点采集法采集地表下20 cm左右深处土壤10 g，装入密封无菌塑料袋中，实验备用.

1.2 培养基及试剂

发酵培养基:葡萄糖31.8 g/L、酵母粉5 g/L、(NH4)2SO42 g/L，,KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，无水CaCl20.1 g/L，NaCl 0.3 g/L，pH 7.0.

斜面培养基：营养肉汤18 g/L，琼脂粉20 g/L，自然pH.

营养肉汤：蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH.

3 mol/L盐酸：7.8 mL蒸馏水+37%盐酸22.2 mL.

丙酮、K2HPO4、Fe SO4、MgSO4、CaCl2、硝酸钾等试剂均为AR.

1.3 设备

QHZ-98A全温度振荡培养箱、MLS-3750全自动高压灭菌器、QHZ-98A干热灭菌箱、UV-2300紫外分光光度计、冰箱、离心机等.

1.4 样品的富集培养及混悬液制备

准确称取土样5 g，放入盛有50 mL营养肉汤的250 mL三角瓶内，37 ℃ 130 r/min,振摇培养24 h后，吸取1 mL的富集悬液，用无菌水倍比稀释，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5几种稀释度的混悬液.

1.5 菌株的分离与纯化

选取10-3、10-4、10-5三个稀释度的混悬液各0.2 mL，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，35 ℃培养20 h～48h.挑选平板上出现的红色菌落，经反复平板划线，分离纯化获得纯菌落，接种至斜面，冰箱保藏待用.

1.6 纯化菌株的发酵

用接种针挑取适量斜面培养基保存菌株，接种于装液量为50 mL/250 mL的种子培养液中，35 ℃，180 r/min恒温震荡培养20 h，获得种子液.再按5%的接菌量将种子液接入装液量为50 mL/250 mL的发酵培养基中，35 ℃，180 r/min恒温震荡培养72 h～96 h.

1.7 发酵液中色素的提取及最大吸收波长的检测

采用酸热破壁法处理菌体细胞[7].取10 mL发酵液进行离心, 8 000 r/min离心 10 min，得到湿菌体.蒸馏水洗涤3次后，加入3 mol/L盐酸15 mL，混匀后室温下振荡浸泡40 min，在沸水浴中煮5 min,迅速冷却,8 000 r/min离心10 min, 弃上清液体.沉淀用蒸馏水洗涤 2～3次后加入4 mL丙酮溶剂，室温下震荡以浸提类胡萝卜素.再5 000 r/min离心10 min,得上清液即为胡萝卜素提取液.如细胞碎片中仍有色素，加提取溶剂进一步浸提，合并提取液.将含色素的丙酮提取液在紫外分光光度计中扫描，得到最大吸收波长.

1.8 目的菌株的培养特性

选用营养肉汤、高氏、LB以及营养肉汤—无机盐复合培养基等四种培养基对分离的目的菌株进行培养，测量不同时间菌株的生物量(OD600 nm),绘制不同培养基下菌株的生长曲线.从曲线的趋势来确定菌株的最适培养基.

各种培养基分别分装至15支试管中，每支装量为4 mL，接菌量100 μL，以不接菌管作为空白对照，每个样设3个平行.试管置于30 ℃、160 r/min摇床培养.每间隔6小时取样一次，测培养物的OD600 nm值.以培养时间为横坐标, OD值为纵坐标，绘制不同培养基下菌株的生长曲线.

选取优化后的培养基进行菌株的发酵培养，丙酮浸提类胡萝卜素.稀释提取液后，紫外分光光度计测得在最大吸收波长下的OD值，按下式计算色素产量：

类胡萝卜素的产量(mg/L)=ODλmax×D×V/0.16×V0.

式中：OD为类胡萝卜素在最大吸收波长处的吸光度值.V为提取色素所用的溶剂量；D为测定试样时的稀释倍数(10)；V0为所用的发酵液总体积；0.16为类胡萝卜素的分子消光系数.

1.9 目的菌株的初步鉴定

分别进行分离菌株的形态特征和生理生化鉴定[7].

2 结果

2.1 产色素菌株的分离与纯化

各试样经富集培养、稀释涂布平板划线法，筛选、分离到表面颜色为橙红色菌落四株，分离菌株的菌落形态如图1所示.

图1 菌株的平板划线分离纯化

2.2 含色素提取液最大吸收波长的测定

将分离获得的四株红色菌株分别进行发酵培养，提取发酵液中色素，将含有色素的丙酮提取液在紫外分光光度计中扫描，得到各菌株的最大吸收波长.菌株J1、J3、J6、J9分别在350 nm、470 nm、375 nm和340 nm处有最大吸收峰.文献报道产类胡萝卜素菌株 HBUT-Y的色素丙酮提取液在465 nm～490 nm 之间有吸收强烈，在477 nm 处有最大吸收峰.分离菌株J3与菌株 HBUT-Y 的强吸收峰基本一致，由此推测：菌株J3可能为产类胡萝卜素菌株.

2.3 菌株最适培养基的确定

从不同培养基下菌株的生长曲线(见图2)可以看出：在高氏培养基中菌株的生长曲线很不规律，表明高氏培养基不适合其生长.而另三种培养基均适合其生长，以营养肉汤—无机盐复合培养基为最佳，从0 h～10 h菌体处于细胞生长的延滞期，细菌代谢活跃，体积增大，为细菌的分裂增殖合成储备酶、能量及中间代谢产物.10 h～54 h为对数生长期，54 h后为稳定期.菌体培养到40 h左右即达到对数生长中期，可选用此期的细胞进行菌株生物活性的测定等研究.

图2 不同培养基下菌株J3的生长曲线

选用营养肉汤—无机盐复合液体培养基进行J3菌株的发酵培养.同法提取发酵液中的红色色素，经测其OD470为0.774 5，胡萝卜素产量约为3.873 mg/L.

2.4 目的菌株的初步鉴定

2.4.1 菌株的菌落及菌体形态特征

菌株J3菌落为橘黄色、圆形、边缘整齐表面光亮无褶皱，直径0.05 cm～0.1 cm.细胞为革兰氏阳性棒杆菌，大小约1*2 um.

2.4.2 菌株J3的生理生化反应

应用微量发酵管，进行J3菌株的生理生化实验，结果见表1.

表1 菌株J3的生理生化反应结果

根据形态学特征和生理生化结果，对照第八版《伯杰细菌鉴定手册》，初步确定菌株J3属于戈登氏(gordonia)菌属.

3 结论

本实验从植物落花土壤中筛选、分离纯化出一株产类胡萝卜素菌株J3，根据形态学特征和生理生化结果，初步确定J3菌属于戈登氏(gordonia)菌属微生物.该菌株无菌丝，易于液体发酵而用于生产.但该菌株的类胡萝卜素产量仅为3.873 mg/L，远低于已报道的类胡萝卜素生产菌株，如光合细菌沼泽红假单胞菌的类胡萝卜素的产量可达 50.2 mg/g[8]，红酵母的产量为 15 mg/L[9].今后应通过诱变技术、采用Plackett-Burman设计优化菌株发酵工艺条件等途径来提高该菌株的类胡萝卜素产量，使其具有一定的生产应用前景.

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2016-11-02

校级开放项目2015135，SYSKF-2016216.

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欧朝萍(1993—)，女，湖南湘平人.

R284.1

A

1009-2102(2016)04-0029-04