王　斐　尹浩军　李　英　周红星

武警湖北总队医院内二科　武汉　430064



面神经损伤大鼠面神经核团中NT-4 mRNA 蛋白质表达变化及意义

王斐尹浩军李英周红星

武警湖北总队医院内二科武汉430064

【摘要】目的 分析面神经损伤大鼠面神经核团中神经营养素-4(NT-4)mRNA及蛋白质表达变化及意义。方法选取50只Wistar大鼠，所有大鼠右侧制造面神经骨管内挤压伤模型，左侧作为自身对照。分别于处理后第1天、第7天、第14天、第21天、第28天采用原位杂交及免疫组化检测大鼠面神经核团中NT-4 mRNA表达细胞数情况，并采用计算机图像分析测定其灰度，NT-4蛋白表达样本进行γ计数。结果正常大鼠面神经核团有较少NT-4表达。面神经损伤大鼠面神经核团中的NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白表达均明显升高，高于正常大鼠。面神经损伤大鼠面神经核团中的NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白表达均于受损初期迅速增高，至损伤后14 d达最高值，随后逐渐降低。结论面神经损伤可刺激大鼠面神经核团NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白的表达，其变化趋势为先迅速上升后逐渐下降，提示NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白表达对面神经损伤的恢复具有重要意义。

【关键词】面神经核团；损伤；Wistar大鼠；神经营养素-4

面神经损伤是临床上最常见的颅神经损伤类型之一，可导致严重的颜面部感觉运动功能异常[1]。利用脑源性神经营养因子治疗和修复面神经损伤是临床研究的热点，对面神经损伤后相关营养因子的变化及其表达具有重要价值[2～3]。本研究利用大鼠建立面神经损伤，测定其损伤后不同时段的NT-4 mRNA和蛋白表达情况，与自身正常侧对比，探讨其变化趋势及病理生理作用。现报道如下。

1材料与方法

1.1实验材料选取成年健康的Wistar大鼠50只由上海义森生物科技有限公司提供，雄性25只，雌性25只，体质量200～300 g，大鼠均在相同条件下喂养，饲料均为普通颗粒饲料。所有大鼠实验分组及模型建立前均检查面神经情况，确认大鼠触须活动和瞬目反射正常后建立模型。实验试剂：鼠疫组化染色试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，TRlzol试剂由北京明阳科华生物科技有限公司提供，逆转录试剂盒由杭州主诺生物技术有限公司提供，兔抗鼠NT-4多克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1分组及建立模型：50只大鼠均建立面神经损伤模型：采用10%水合氯醛(3 mL/kg)进行腹腔注射全麻，操作过程中维持体温。于大鼠右耳后方作切口，切开皮下组织后暴露面神经，根据面神经走行至径乳孔方向，夹碎面神经垂直段与水平段交界处颞骨，封闭伤口，缝合。所有大鼠左侧作为自身对照，麻醉切开与右侧相同，暴露面神经后不进行碎骨处理，封闭伤口，缝合。利用随机数表法将所有大鼠分为第1天、第7天、第14天、第21天、第28天5个小组，每组10只。各组大鼠建立模型后混合喂养。

1.2.2标本处理及染色观察：①NT-4 mRNA灰度测定采用RT-PCR测定：分别于各小组相应时间处死大鼠，进行标本制备观察。大鼠处死后剪开原模型建立切口，采集10只大鼠脑干面神经核团水平标本。将标本置于-80 ℃冰箱封存。利用玻璃匀浆器将标本于液氮中研碎，并加入TRlzol试剂处理，提取总RNA。采用紫外分光光度计测定浓度后行反转录处理。PCR扩增处理提取的mRNA，并于1.5%～2.0%琼脂糖电泳池中电泳，暗室照相后对特异性增条带进行光密度扫描，计算平均灰度[4-5]。②NT-4 mRNA阳性细胞数采用组织原位杂交测定：处死与上述相同，获得标本后保存于液氮中，并利用鼠NT-4 mRNA碱基序列为模版，进行漂浮法原位杂交，完成后进行染色。光镜500倍视野下观察mRNA阳性神经元数目[6]。③面神经核团NT-4蛋白采用γ计数进行测定：处死与上述相同，在放大镜观察下使用电钻和绞骨钳分离大鼠脑干面神经核团，并保存清洁测试管内，对样本进行γ计数，测定NT-4阳性细胞数[7]。

2结果

2.1面神经损伤后大鼠面神经核团NT-4 mRNA阳性细胞数情况观察大鼠面神经损伤后面神经核团NT-4 mRNA阳性细胞数。可见大鼠损伤侧的面神经NT-4 mRNA阳性细胞数呈先上升后下降的趋势，于第14天达到高峰。且大鼠损伤侧第7天、第14天、第21天、第28天的面神经核团NT-4 mRNA阳性细胞数均明显高于正常侧，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　面神经损伤后大鼠面神经核团NT-4 mRNA阳性细胞数比较　±s，个)

2.2面神经损伤后大鼠面神经核团NT-4 mRNA灰度情况比较观察大鼠面神经损伤后面神经核团NT-4 mRNA灰度情况。可见损伤侧的面神经核团NT-4 mRNA灰度呈先上升后下降的趋势，于第14天达到高峰。且大鼠损伤侧第7天、第14天、第21天、第28天的面神经核团NT-4 mRNA灰度均明显高于正常侧，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3面神经损伤后大鼠面神经核团NT-4蛋白情况比较大鼠损伤侧的面神经核团NT-4蛋白γ计数呈先上升后下降的趋势，于第14天达到高峰。且大鼠损伤侧第7天、第14天、第21天、第28天的面神经核团NT-4蛋白γ计数均明显高于正常侧，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表 2　面神经损伤后大鼠面神经核团NT-4 mRNA

表3　面神经损伤后大鼠面神经核团NT-4蛋白γ计数情况比较　±s，cpm)

3讨论

染色后各组大鼠着色情况比较发现，正常面神经核团可观察到分布较广泛的蓝紫色信号。通过高倍镜观察可见，神经元细胞核周和胞浆有明显着色，其中核膜着色最明显，部分神经元细胞胞浆与胞核之间有明显界限。与相关研究中可通过免疫组化染色观察神经营养素表达情况的结论相符[8-9]。同时观察到NT-mRNA蓝紫色信号在腹侧核最明显，且主要为大多角形的神经元细胞，部分周围胶质细胞染色染色相对较浅。观察还发现，在蓝紫色信号区域可见较明显棕黄色着色物质，高倍镜观察可见明显胞浆着色，且胞核无明显染色。此为NT-4蛋白，与NT-4 mRNA分布位置基本一致，是重要的神经营养素。

在对大鼠损伤后第1天NT-4 mRNA染色观察中发现，损伤与未损伤两侧面神经核团染色情况比较差异并不明显，说明在面神经损伤初期大鼠的NT-4 mRNA含量情况变化并不明显。研究[10-11]指出，在面神经损伤的最初期，其营养因子的mRNA的变化并不明显，随着时间的推移出现代偿性增高。在面神经损伤第7天进行染色观察，发现面神经损伤侧的神经元着色信号明显增加。损伤侧500倍视野NT-4 mRNA阳性细胞数为(39.31±5.42)个，正常侧为(34.21±4.33)个，损伤侧NT-4 mRNA阳性细胞数更多，浓度更高。同时，在对蛋白质表达情况的观察中也发现，损伤侧NT-4蛋白阳性γ计数为(1 192.5±128.1)cpm，明显高于正常侧的(914.5±128.4)cpm。结果证明，在面神经损伤后第7天，损伤侧的NT-4 mRNA含量及蛋白表达情况均明显高于正常侧。

研究显示，脑神经损伤后，多种神经营养因子如NT-3和NT-4等均可能出现不同程度的反应性增加[12]。尤其是在神经损伤部位其分泌和表达情况最明显，而作为神经修复重要部位的神经核团，神经营养素的高表达具有重要意义[13]。面神经损伤后的神经修复需要NT-4等大量相关促神经生长因子作用，因此，在面神经核团处NT-4的高表达可促进神经损伤修复[14]。

随着损伤时间的不断推移，本研究中大鼠面神经损伤侧的NT-4 mRNA含量呈逐渐升高后下降的趋势。研究显示，大鼠面神经损伤后，面神经核团将分泌大量营养因子促进其功能恢复[15]。第14、21、28 d的染色结果发现，损伤组大鼠的面神经NT-4 mRNA阳性细胞数于损伤后先上升，至第14天达到高峰，而后不断下降。在这一变化过程中大鼠损伤侧的面神经核团NT-4 mRNA阳性细胞数均明显高于正常侧。但在损伤后第28天的染色结果分析中发现，二者阳性细胞数比较并无明显差异。在对NT-4 mRNA电泳带灰度情况比较中也得出相同结论，说明损伤后面神经核团NT-4 mRNA阳性细胞数增加，且NT-4 mRNA的总含量明显上升，于损伤后28 d方恢复至正常水平。同时，本研究也发现损伤后面神经核团中，神经营养素的表达的变化趋势与其mRNA浓度情况变化相一致。

综上所述，面神经损伤后，面神经核团NT-4 mRNA含量增高，促使NT-4蛋白的表达。损伤后其变化趋势为先迅速上升后逐渐下降，NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白表达对面神经损伤的恢复具有重要意义。损伤后可使用外源性神经营养素提高恢复效果，改善症状。

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(收稿2015-03-03)

【中图分类号】R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1673-5110(2016)04-0038-03