杨文栋，苏　超，张春燕，赵亚丽，任媛媛，高星杰，杨　洁，，何津岩（天津医科大学.细胞生物学系；.基础医学研究中心；.医学生物化学与分子生物学系，天津　00070）



重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达

杨文栋1，苏超2，张春燕3，赵亚丽1，任媛媛3，高星杰2，杨洁1，2，何津岩1
（天津医科大学1.细胞生物学系；2.基础医学研究中心；3.医学生物化学与分子生物学系，天津300070）

摘要目的：构建Tudor-SN蛋白的Serine426（S426）、Serine781（S781）、Threonine240（T240）和Threonine429（T429）的点突变质粒，并使该重组质粒能够在HeLa细胞中融合表达。方法：利用定点突变技术，对Tudor-SN蛋白进行S426A、S781A、T240A、T429A点突变，通过双酶切的方法获得Tudor- SN.Mutants片段，最后将其连入到pCMV-N-Flag载体中。在HeLa细胞中转染该质粒，利用Western blot技术检测质粒表达效率。结果：（1）重组质粒经双酶切鉴定，可以观察到载体与Tudor-SN.Mutants的条带。（2）转染突变质粒后可看出HeLa细胞中有Flag蛋白表达。结论：质粒构建成功，可以用于下一步科学研究使用。

关键词人类Tudor-SN蛋白；pCMV-N-Flag；重组质粒；融合蛋白

Construction and expression of recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants Flag plasmids

YANG Wen-dong1,SU Chao2,ZHANG Chun-yan3,ZHAO Ya-li1,REN Yuan-yuan3,GAO Xing-jie2,YANG Jie1,2,HE Jin-yan1
（1.Department of Cell Biology；2.Research Center of Basic Medical Science；3.Department of Medical Biochemistry,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Abstract Objective:To construct eukaryotic Flag expressing recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag.Methods：The Serine426 （S426）,Serine781（S781）,Threonine240（T240）and Threonine429（T429）of Tudor-SN were transformed into Alanine by site- directed mutagenesis technique.Then the Tudor-SN.Mutants were obtained by restricting double enzyme digestion,and then inserted into pCMVN-Flag vector.The recombinant plasmids were transfected into HeLa and observed by Western blot.Results：（1）The vectorand Tudor-SN.Mutants could be observed by restricting double enzyme digestion.（2）Flag was expressed by HeLa which was transfected with recombinant plasmid.Conclusion：The recombinant plasmids of pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag are constructed successfully,and may be useful for furtherstudy.

Key words human Tudor-SN；pCMV-N-Flag；recombinant plasmid；fusion protein

人类Tudor-SN蛋白，又称SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）或p100，该蛋白首次以EB病毒细胞核抗原2（epstein-barr virus nuclear protein 2，EBNA2）的转录共激活因子被发现[1]。疏水簇结构分析（hydrophobic cluster analysis，HCA）显示，人类Tudor-SN蛋白由N端4个连续的葡萄球菌核酸酶样的（phylococcal nucleases-like，SN）SN （1～4）结构域和C端的Tudor-SN5（TSN）组成[2]。近些年，本课题组研究发现Tudor-SN蛋白是一种多功能蛋白，可参与多种生物学行为，例如：细胞周期[3]、脂代谢[4]、细胞应激[5]等，并在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[10-13]。为了进一步揭示其发挥功能的具体机制，笔者通过生物信息学的方法预测了Tudor-SN蛋白Serine426（S426）、Serine781（S781）、Threonine240 （T240）、Threonine429（T429）为其潜在磷酸化位点，并利用定点突变技术将上述位点进行突变，然后将含有突变位点的片段连入到pCMV-N-Flag载体中，成功构建了pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag的重组质粒，从而为深入研究Tudor-SN蛋白的结构和功能提供了便利工具。……