张长风　张玉琴　余利岩　李淑英

中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所　北京　100150；①华北理工大学基础医学院



小月菌属放线菌分离鉴定程序及生物学特性分析

张长风张玉琴余利岩李淑英①

中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所北京100150；①华北理工大学基础医学院

[摘要]①目的探讨小月菌属放线菌的生物多样性，更好地开发利用放线菌的次级代谢产物及新型药物的研制。②方法通过对培养特性、形态特征、生理生化反应、细胞化学组分、系统发育等方面的分析，对小月菌属放线菌分离鉴定程序加以归纳，探讨其生物学特性。③结果该菌属形成圆形凸起、表面光滑、无光泽菌落；革兰阳性菌；胞壁肽聚糖的主要二氨基庚二酸均为meso-DAP和LL-DAP，主要的甲基萘醌均为MK-9(H4)。④结论小月菌属与近缘属相关菌构建的系统进化树上形成独立的分枝。

[关键词]小月菌属放线菌分离鉴定

小月菌属(Microlunatus)是具有磷酸盐降解潜力的放线菌，并含有生物次级代谢产物合成的部分关键酶基因，是基因工程生物合成的新基因材料及新的化学药物生产的基本原料[1]。为进一步了解小月菌属放线菌的生物多样性，更好地开发利用小月菌属放线菌天然产物资源，本文从培养特性、形态特征、生理生化反应、细胞化学组分、系统发育等方面对小月菌属放线菌的分离鉴定程序加以归纳，并探讨其生物学特性，以便今后能够更有效地分离发现更多新型菌株，从而为新型生物基因材料及药物的开发奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源。岩洞土壤[2]、种植高丽参的土壤[3]、红豆杉的根际土[4]、海莲树皮[5]、食用菌的土壤[6]、室内的墙体中[7]及海洋沉积物[1]等不同环境。

1.1.2分离培养基。常用高氏培养基。

1.1.3形态及培养特性观察。常用普通光学显微镜及电子显微镜观察；用ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏琼脂培养基、马铃薯浸汁琼脂培养基及营养琼脂培养基进行培养特性观察。

1.1.4生理生化反应。主要包括pH、盐浓度、温度耐受、全细胞水解物糖。

1.1.5细胞化学组分分析。甲基萘醌成分、细胞壁肽聚糖成分、磷酸类脂的组成成分、主要脂肪酸的分析及细胞DNA G+C含量分析。

1.1.6系统进化方面分析。提取基因组DNA，进行16S rRNA基因序列扩增，然后在GenBank中Blast进行基因比对，应用MEGA软件中的邻接法分析，建立系统进化树。

2结果

2.1培养特性菌落直径一般在0.5～2.0mm范围内、圆形凸起、表面光滑、无光泽，淡黄色(或白色)[4]。

2.2形态特征细胞形态为半球形(0.8～2.0μm)，并且以单一、成对或成簇的形式存在。处于稳定生长期的成对细胞在细胞结合处共用同一细胞壁结构。细胞无运动能力，不形成孢子，革兰染色阳性[2]。

2.3生理生化反应特性代谢类型为化能异养，以糖和糖醇作为底物的严格好氧菌，生长速率缓慢。不耐酸，适宜生长的pH值范围为5～9；嗜中温温度范围20℃～30℃；无NaCl耐受能力，报道的部分菌株全细胞水解物糖包括：阿拉伯糖(arabinose)、半乳糖(galactose)、鼠李糖(rhamnose)、葡萄糖(glucose)[3,4,7]。

2.4细胞化学组分分析小月菌属主要化学成分甲基萘醌为MK-9(H4)，胞壁I型，部分菌株含有少量(<10%)MK-8(H4)；胞壁肽聚糖的主要二氨基庚二酸是LL-DAP，肽聚糖中的氨基酸还有丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glutamic)，胞壁肽聚糖类型为A3γ’，其中M.phosphovoms和M.soli的肽桥只包含一个甘氨酸；磷酸类脂主要包括双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)；主要的脂肪酸为anteiso-C15:0，iso-C15：0和iso-C16:0，小月菌属DNA的G+C含量范围为65.1～70.9moL%[3～5,7]。

表1　小月菌属及相关菌属的分类学特征

注：ND，无数据；PG，磷脂酰甘油；DPG，双磷脂酰甘油；PI，磷脂酰肌醇；GL，未定糖脂；PL，未定磷脂。

2.5系统进化分析小月菌属各个种之间的序列相似性都在96%以上；在丙酸杆菌科相关菌株的16S rRNA基因序列构建的系统进化树中形成一个稳定的分枝[2～4]。其他相关属与小月菌属的生物学特征如表1所示。小月菌属于丙酸杆菌科，丙酸杆菌科16S rRNA的特征核苷酸包括：688:699(G-C),701(C),823:877(G-C)和1060:1197(U-A)[7～9]。在基于16S rRNA基因序列构建的系统进化树上，小月菌属与弗莱德门菌属(Friedmanniella)、微白霜菌属(Micropruina)及产丙酸单胞菌属(Propionicimonas)等[8～10]为邻(如图1)；但小月菌属与近缘属相关菌株构建的系统进化树上形成独立的分枝。

3讨论

近年来，随着不同生理环境的微生物资源开发利用，越来越多的小月菌属也在更广阔的生物环境中被发现：海洋环境[1]、岩洞土壤[2]、种植高丽参的土壤[3]、红豆杉的根际土[4]、海莲树皮[5]、食用菌的土壤[6]及室内的墙体中[7]等。小月菌属的分离鉴定是通过经典分类学方法确定的，如：表型特征、形态特征、化学分类特征、分子分类学(如：16S rRNA基因序列比对)等生物学特性方法。

图1　基于丙酸杆菌科菌株的165rRNA基因序列构建的系统进化树

新的物种放线菌的获得是获得新型次级代谢产物(即获得新的生物资源)的重要前提之一；目前，小月菌属的获得主要是基于16SRNA序列分析及其生物学特性分析。随着大规模测序技术的发展，已经完成了864株放线菌株的全基因组序列分析，基于基因组学创立的“基因组系统发育学”将为新的小月菌属放线菌的发现提供科学依据。随着应用技术的发展和分类鉴定方法的扩充，越来越多的小月菌属将被分离、发现；同时，也为小月菌属的实际应用奠定基础。

参考文献

[1]Yuan M,Yu Y,Li HR,et al.Phylogenetic diversity and biological activity of actinobacteria isolated from the Chukchi Shelf marine sediments in the Arctic Ocean[J].Mar Drugs,2014,12(3):1281-1297

[2]Cheng J,Chen W,Huo-Zhang B,et al.Microlunatus cavernae sp.nov,a novel actinobacterium isolated from Alu ancient cave,Yunnan, South-West China[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2013,104 (1):95-101

[3]An DS,Im WT,Yoon MH.Microlunatus panaciterrae sp. nov., a beta-glucosidase-producing bacterium isolated from soil in a ginseng field[J].Int J Syst Evol Microbiol,2008,58(12):2734-2738

[4]Wang YX,Cai M,Zhi XY,et al.Microlunatus aurantiacus sp.nov,a novel actinobacterium isolated from a rhizosphere soil sample[J].Int J Syst Evol Microbiol,2008,58(8):1873-1877

[5]Tuo L,Li J,Liu SW,et al.Microlunatus endophyticus sp. nov,a novel endophytic actinobacterium isolated from bark of Bruguiera sexangula[J].Int J Syst Evol Microbio,2015,doi:10.1099/ijsem.0.000779.[Epub ahead of print].

[6]Kämpfer P1,Young CC,Busse HJ,et al.Microlunatus soli sp.nov,isolated from soil[J].Int J Syst Evol Microbiol,2010,60(Pt 4):824-827

[7]Kämpfer P,Schäfer J,Lodders N,et al.Microlunatus parietis sp.nov,isolated from an indoor wall[J].Int J Syst Evol Microbiol,2010,60(Pt 10):2420-2423

[8]Iwai K,Aisaka K,Suzuki M.Friedmanniella luteola sp.nov,Friedmanniella lucida sp.nov,Friedmanniella okinawensis sp.nov.andFriedmaniella sagamiharensis sp.nov,isolated from spiders[J].Int J Syst Evol Microbiol,2010,60(Pt 1):113-120

[9]Zhang X,Zhang J,Zhang Y,et al.Friedmanniella flava sp.nov,a soil actinomycete[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2013,63(5):1771-1775

[10]Zhi XY,Li WJ,Stackebrandt E.An update of the structure and 16S rRNA gene sequence-based definition of higher ranks of the class Actinobacteria,with the proposal of two new suborders and four new families and emended descriptions of the existing higher taxa[J].Int J Syst Evol Microbiol,2009,59(3):589-608

(张爱国编辑)

Procedures of isolation & identification and analysis of biological characteristic for genus microlunatus actinomyces

ZHANGChangfeng，ZHANGYuqin,YULiyan，et

al(InstituteofMedicinalBiotechnology,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

[ABSTRACT]ObjectiveIn order to further understand biodiversity of the genus microlunatus actinomyces,exploitate the secondary metabolites,and develop new drugs.MethodsThe procedures of isolation and identification were summarized,and the biological characteristic were analysed by analysis of cultivating characteristics,morphological characteristics,physiological and biochemical reaction,cell composition and phylogenyetic.ResultsCulture features results showed that the genus microlunatus formed colonies with round convex,smooth of surface,without burnish and Gram positive.meso-DAP and LL-DAP were peptidoglycan composition of the cell wall, MK-9(H4) was as the predominant menaquinone.ConclusionGenus microlunatus actinomyces established an independent branch in neighbour-joining phylogenetic evolutionary tree with related relatives system.

[KEYWORDS]Microlunatus. Actinomycetes. Isolation. Identification

[中图分类号]Q 939

[文献标识码]A

[文章编号]2095-2694(2016)02-85-03

【通讯作者】李淑英。

【作者简介】张长风(1990-)，男，硕士研究生。研究方向：微生物学。

【基金项目】河北省留学人员科技活动择优资助项目(编号:C20140059)。