金钥，崔进，梅连瑞，李经纬，闫师杰，刘祥，*（1.天津农学院水产学院，天津300384；.国家加工食品质量监督检验中心，天津300308；3.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384；4.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384）



HPLC同时测定豆制品中3种碱性橙染料

金钥1，2，崔进2，梅连瑞2，李经纬2，闫师杰3，4，*，刘祥2，*
（1.天津农学院水产学院，天津300384；2.国家加工食品质量监督检验中心，天津300308；3.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384；4.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384）

摘要：建立腐竹等固体豆制品中碱性橙2、碱性橙21和碱性橙22染料含量的高效液相色谱检测方法。样品经无水乙醇提取，超声波辅助萃取，离心合并上清液，经旋转蒸发仪浓缩至近干，定容液溶解残渣，离心吸取上清液，过0.45 μm膜经高效液相色谱分离、检测。所用色谱柱为C(18)，检测波长碱性橙2为449 nm，碱性橙21、碱性橙22为485 nm；流动相为甲醇-乙酸铵水溶液。本方法检测限为0.02 mg/kg；定量限为0.08 mg/kg。腐竹样品加标回收率试验所得回收率为83.1 %～116.7%，相对标准偏差（RSD）为1.02%～9.65%（n=6），3种染料在0.1μg/mL～20μg/mL浓度范围内均呈良好的线性关系，线性回归系数（r）均大于0.9999。

关键词：高效液相色谱法；豆制品；碱性橙2；碱性橙21；碱性橙22

碱性橙是一种偶氮类碱性工业染料，主要用于纺织品、皮革制品及木制品的染色，对人有致癌、致畸变等影响。根据《中华人民共和国食品安全国家标准食品添加剂使用标准》及《中华人民共和国食品安全法》的相关规定，为禁止用作食品添加剂的化学制品，而由于碱性橙染料比其它水溶性染料如柠檬黄、日落黄等更易于在鲜海鱼和豆制品上染色且不易褪色，因此一些不法商贩为了增加食品的色泽光亮，以次充好，在鲜海鱼、豆制品、腐竹等食品中使用碱性橙染色[1]，极大危害了消费者的身心健康。为保护消费者的健康，通过对此类食品进行定性和定量检测，有效地保障了食品的市场安全。

碱性橙染料的种类主要有碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22 3种[2]。目前较多使用高效液相色谱法进行分析检测，但前处理相对繁琐，耗时较长且浪费溶剂[3-4]。本研究建立了通过无水乙醇提取，超声波辅助萃取的前处理方法，冷冻离心去除脂类，省去了液液萃取去除脂类的步骤，利用HPLC同时检测碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22的含量，取得了满意的效果。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

Waters H-Class高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器：Waters公司；ML204/02天平：Mettler-Toledo公司；FB15060超声波清洗器、ST 16R低温高速离心机：美国Thermo Fisher公司；RV 10旋转蒸发仪、A11分析研磨机、VORTEX圆周混合器：德国IKA公司。

超纯水：Milli-Q Integral 10，法国Merck Millpore公司；甲醇：色谱纯，美国Honeywell公司；碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22：均为国家标准物质，德国Dr.公司。1.2标准物质配制

储备液的配制：分别准确移取100 mg（精确至0.1 mg）碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，混匀，4℃条件下避光保存；中间液的配制：分别准确移取1 mL碱性橙染料标准储备液于10 mL容量瓶中，用定容液至刻度，混匀；工作液的配制：准确移取适量中间液于10 mL容量瓶中，分别配制为浓度0.1、0.5、1、2、20μg/mL，用定容液至刻度，混匀备用。用流动相作为定容液进行定容。

1.3样品处理方法

称取5 g（精确到0.01 g）粉碎好的干腐竹[5]样品于50 mL塑料离心管内，加入2 g无水硫酸钠[6]，10 mL无水乙醇超声提取20 min，9 000 r/min，离心5 min，上层清夜置于另一离心管中，重复提取2次，合并提取液；再5 000 r/min，离心10 min；转移上清液于圆底烧瓶中，在30℃，60 r/min减压的条件下旋转蒸发至近干；加入5 mL定容液，用超声清洗仪溶解残渣[7]，转移至离心管，9000r/min，离心5min，吸取上清液，经0.45μm滤膜过滤，供高效液相色谱仪上机分析检测。

1.4色谱分析条件

色谱柱：4.6 mm×150 mm，C18反相柱（5 μm）；检测波长：碱性橙2为449 nm；碱性橙21、碱性橙22为485 nm；流动相：甲醇：水（含0.02 mol/L乙酸铵）为62∶ 38（体积比）；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；进样量：10.0 μL。

2　结果与讨论

2.1样品前处理条件的优化

分别考虑了无水乙醇、甲醇、乙腈对阳性样品的萃取试验，结果3种有机试剂的提取效率差别不大，而考虑乙腈、甲醇毒性均比无水乙醇大，价格也相对比无水乙醇高，选择无水乙醇作为提取剂；提取剂的用量比较了5、10、20 mL，结果为5 mL提取不充分，而20 mL浪费提取剂且旋转蒸发慢，10 mL时提取充分且旋蒸快；对超声萃取时间和提取次数综合考虑，时间考虑了15、20、30 min，提取次数考虑了1、2、3次。结果显示，无水乙醇超声萃取20 min，提取2次，提取不但完全而且节约时间；而根据腐竹样品中含有脂类，以往文献均采用液液萃取的方法去除脂类，本文中定容液溶解残渣后，不经液液萃取，而是残渣转移至离心管中，用冷冻离心机进行离心，去除样品中脂类等杂质，上清液过膜上机检测。

2.2色谱分离条件的优化

分别考虑了Waters symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Waters symmetry Shied RPC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色谱柱，结果为Waters symmetry C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）的分离效果好，各标准物质的保留时间短、峰型好；检测器方面对检测波长进行了筛选，结果显示碱性橙2的检测波长为449 nm；碱性橙21、碱性橙22的检测波长为485 nm；同时也比较了乙腈：水（含0.02 mol/L乙酸铵）、乙腈：水（含0.1 %甲酸）、甲醇：水（含0.02 mol/L乙酸铵）、甲醇：水（含0.1 %甲酸）不同流动相体系[8]，综合各种不同的流动相和流动相配比，发现甲醇：水（含0.02 mol/L乙酸铵）为62∶38（体积比）时，体系能够更有效地分离，色谱峰形更优，灵敏度更高，因此选用甲醇：水（含0.02 mol/L乙酸铵）为62∶38（体积比）作为流动相。图1、图2为3种碱性橙染料的标准图谱。

图1碱性橙21、碱性橙22在485 nm下标准物质色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of basic orange 21 and basic orange 22 standards determined by UV detector at 485 nm

图2碱性橙2在449 nm下标准物质色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of basic orange 2 standard determined by UV detector at 449 nm

2.3线性情况、定量限、检出限、回收率及相对标准偏差

用已经配制好的标准工作液，各浓度分别进样10.0 μL，测定结果经线性回归，线性良好，结果如图3、图4、图5。

图3碱性橙2在线性范围0.1 μg/mL～20 μg/mL的校正曲线Fig.3 Calibration curve of basic orange 2 in 0.1 μg/mL-20 μg/mL

图4碱性橙21在线性范围0.1 μg/mL～20 μg/mL的校正曲线Fig.4 Calibrationcurveofbasicorange21in0.1 μg/mL-20 μg/mL

图5碱性橙22在线性范围0.1 μg/mL～20 μg/mL的校正曲线Fig.5 Calibrationcurveofbasicorange22in0.1 μg/mL-20 μg/mL

用腐竹空白样品作为基质，添加不同量的碱性橙染料标准品后按“1. 2”处理后测定，确定各碱性橙染料的线性范围、定量限（LOQ，S /N>10）、检出限（LOD，S/N >3），见表1；不同添加量下的回收率和相对标准偏差，见表2；同时测定阴性样品，得到空白样品色谱图，如图6；添加水平1 mg/kg的样品色谱图，如图7、8。

表1碱性橙染料的线性情况以及定量限、检出限Table 1 Linear regression，correlation coefficient and the limit of detection and quantitation

表2碱性橙染料回收率试验结果Table 2 Results of test for recovery

图6空白样品色谱图Fig.6 Chromatogram of blank sample

图7碱性橙21、22添加1 mg/kg样品色谱图Fig.7 Chromatogram of basic orange 21 and 22 add 1 mg/kg

图8碱性橙2添加1 mg/kg样品色谱图Fig.8 Chromatogram of basic orange 2 add 1 mg/kg

3　结论

建立了腐竹中禁用碱性橙染料的高效液相色谱检测方法。用乙醇多次超声萃取，用冷冻离心机去除脂类等杂质，采用超声法和冷冻离心机进行的样品前处理成本低、速度快；用甲醇-乙酸铵水溶液作流动相。方法具有灵敏度高、重现性好、回收率较高的特点，各项指标满足分析的要求，适合腐竹等固体豆制品中碱性橙染料的检测。

参考文献：

[1]林钦,郑小严,何树坤,等.高效色谱法同时检测食品中的碱性橙、碱性嫩黄O和碱性桃红T染料含量[J].食品科学, 2009, 30(14): 194-196

[2]杨琳,陈青俊,丁献荣,等.高效液相色谱法测定食品中3种碱性橙含量[J].理化检验(化学分册),2011(7):768-770

[3]高洁,尹峰,何国亮,等.高效液相色谱法测定豆制品中的碱性嫩黄O[J].分析试验室,2008,27(Z1):230-232

[4]罗美中,李碧芳,何小青.高效液相色谱-二极管阵列法测定豆制品中碱性嫩黄O的含量[J].食品工业科技,2005,26(8):166-167

[5]林灿城,游卓铭.腐竹中碱性嫩黄O和碱性橙Ⅱ测定方法探讨[J].广东卫生防疫,2013(5):82-83

[6]林钦.高效液相色谱法同时测定豆制品中的碱性橙和碱性嫩黄O染料[J].色谱,2007,25(5):776-777

[7]江迎鸿,陈亚波,邱舜钿,等.超声提取-高效液相色谱法测定食品中碱性橙Ⅱ染料[J].食品研究与开发,2009,30(7):153-155

[8]铁晓威,黄百芬,任一平,等.RP-HPLC法测定染色黄鱼中的碱性橙含量[J].中国卫生检验杂志, 2004, 14(1):59-60

HPLC Determination of 3 Basic Orange Dyes in Bean Products

JIN Yue1，2，CUI Jin2，MEI Lian-rui2，LI Jing-wei2，YAN Shi-jie3，4，*，LIU Xiang2，*
（1. College of Aquaculture，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2. National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food，Tianjin 300308，China；3. College of Food Science and Biological Engineering，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；4. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China）

Abstract：A method for the simultaneous determination of basic orange 2，basic orange 21 and basic orange 22 contents in bean products was developed by high performance liquid chromatography（HPLC）. The sample was extracted by ethanol and sonicator，then centrifuged by centrifuge，the extracts were combined in vacuum to dryness，the residue was dissolved in a given solution，drew supernatants were after centrifuged，separated and detected by HPLC after 0.45 μm membrane. The column was C(18)，the detection wavelength basic orange 2 is 449 nm，basic orange 21，basic orange 22 are 485 nm；mobile phase was methanol-aqueous ammonium acetate. The linear ranges of this method for determining the three pigments were 0.1 μg/mL-20 μg/mL and the correlation coefficients（r）all were higher than 0.999 9. The recoveries at three levels respectively ranged from 83.1 % to 116.7 %，and the RSDs were 1.02 %-9.65 %（n= 6）. The limits of detection were about 0.02 mg/kg，the limit of quantitation were about 0.08 mg/kg.

Key words：high performance liquid chromatography；bean products；basic orange 2；basic orange 21；basic orange 22

收稿日期：2015-04-17

*通信作者：闫师杰（1971—），男（汉），教授，博士，主要从事食品质量与安全方面的研究与教学；刘祥（1976—），男（汉），正高级工程师，博士，主要从事食品安全检测与分析。

作者简介：金钥（1990—），女（汉），在读硕士研究生，主要从事动物性食品安全与营养方面的研究。

基金项目：国家重大科学仪器设备开发专项（2013YQ510391）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.036