仇志富，吴晓光，孟杰，祖炳学，李蒙蒙，苗惠，时召平

(1承德医学院，河北承德067000；2承德医学院河北省中医药抗痴呆重点研究室；3承德医学院附属医院；4抚宁县第二人民医院；5承德市中医院)



补阳还五汤提取物灌胃对脑出血大鼠脑组织中PI3K、AKT、Caspase-3表达的影响

仇志富1，吴晓光2，孟杰3，祖炳学4，李蒙蒙1，苗惠1，时召平5

(1承德医学院，河北承德067000；2承德医学院河北省中医药抗痴呆重点研究室；3承德医学院附属医院；4抚宁县第二人民医院；5承德市中医院)

摘要：目的观察补阳还五汤提取物对脑出血大鼠脑组织磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、丝/苏氨酸蛋白激酶(AKT)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)表达的影响，探讨其对脑组织的保护作用机制。方法 将72只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组、银杏叶片组各18只，后4组采用Rosenberg法建立脑出血大鼠模型后，分别给予生理盐水、补阳还五汤提取物、银杏叶片连续灌胃35 d。用免疫组化法检测PI3K、AKT、Caspase-3蛋白表达，TUNEL法检测脑组织细胞凋亡情况，干湿重法检测脑组织含水量，甲酰胺法检测血-脑脊液屏障通透性。结果与模型组比较，补阳还五汤组、银杏叶片组PI3K、AKT蛋白表达水平升高，Caspase-3蛋白表达水平降低，脑组织含水量、凋亡细胞数减少，血-脑脊液屏障通透性降低(P均<0.05)。结论 补阳还五汤提取物可能通过激活PI3K/AKT信号通路，降低血-脑脊液屏障通透性来保护脑出血大鼠脑组织。

关键词：脑出血；补阳还五汤；磷脂酰肌醇3激酶/丝/苏氨酸蛋白激酶信号通路；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3;大鼠

脑出血后发生细胞凋亡的机制复杂多样，细胞凋亡过程涉及的信号转导通路中，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝/苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号转导通路极为重要，其可通过调控凋亡蛋白和凋亡基因来抑制细胞凋亡[1]。补阳还五汤可用于治疗缺血性、出血性脑病，能通过减少神经元死亡、促进神经修复再生等机制来发挥作用。补阳还五汤能够激活数条与细胞凋亡联系密切的信号转导通路[2]，然而其对PI3K/AKT信号转导通路的影响却鲜见报道。2014年12月~2015年7月，本研究观察补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织的保护作用，并探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1动物及试剂成年雄性清洁级SD大鼠72只，体质量(250±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。中药(补阳还五汤组成：生黄芪120 g、当归尾6 g、赤芍4.5 g、川芎4.5 g、干地龙3 g、桃仁3 g、红花3 g)购自承德大药房，银杏叶片购自双鹤药业有限公司。补阳还五汤通过水煎醇沉法制备浓度为5.0 g/mL的提取物备用，4 ℃冰箱保存；银杏叶片研磨成细粉以双蒸水送服。PI3K、AKT兔抗大鼠多克隆免疫组化试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)检测试剂盒购自上海志研生物科技有限公司；TUNEL凋亡检测试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司；其他试剂皆为国产分析纯。

1.2动物分组与模型制备将大鼠随机分为4组：假手术组、模型组、补阳还五汤组、银杏叶片组，各18只。脑出血大鼠模型的制备参考文献[3]，以10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射，大鼠麻醉后固定于立体仪上，于头部正中行纵行切口，将大鼠骨膜剥离，使其冠状缝和前囟裸露。在前囟之前约2.0 mm、中线右侧约3.0 mm处钻一约1.0 mm直径的小孔。以微量注射器从股动脉抽取适量的血液，借助立体定向仪沿钻孔垂直进针6.0 mm左右，缓缓注血80 μL，留针10 min后撤针，以消毒针缝合切口。假手术组仅裸露颈总动脉、神经。造模第2天，补阳还五汤组、银杏叶片组灌胃给药，药量分别为26 g/(kg·d)、3.5 mg/(kg·d)，假手术组及模型组给予生理盐水10 mL/kg，均连续给药35 d。

1.3脑组织PI3K、AKT、Caspase-3蛋白表达检测采用免疫组化法。最后1次给药后12 h，每组随机选6只大鼠，以乙醚麻醉断头处理，选取视交叉至漏斗部之间的脑组织，10%甲醛于4 ℃冰箱固定48 h，石蜡包埋，冠状切片5 μm厚，常规脱蜡、乙醇浸水，以枸橼酸盐缓冲液微波法进行抗原修复，水洗后分别滴加兔抗大鼠PI3K(1∶150)、AKT(1∶100)多抗，于4 ℃下静置12 h，孵育30 min，DAB显色后苏木精复染，常规脱水、透明、封片。PI3K、AKT蛋白相对表达量计算采用MiVnt图形采集分析系统检测阳性细胞吸光度值，取平均值，利用PBS作阴性对照。Caspase-3蛋白表达检测严格按照试剂盒说明操作，于酶标仪435 nm波长处检测吸光度值，Curve Expert 1.0软件经对照品的标准曲线计算样品Capase-3蛋白相对表达量。

1.4脑组织凋亡细胞计数取脑组织标本，采用缺口末端标记法(TUNEL法)原位检测细胞凋亡变化，严格按照TUNEL凋亡检测试剂盒操作说明进行。计数每视野凋亡细胞数量。

1.5脑组织含水量测算各组分别取6只大鼠断头、取脑，去除嗅球部分，称湿重后于90 ℃干燥箱干燥24 h，再称重。计算脑组织含水量，含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.6血-脑脊液屏障通透性检测取各组剩余6只大鼠，于尾部静脉注射2%伊文思蓝(EB)，3 h后以水合氯醛麻醉，于大鼠左心室注射0.2 L生理盐水冲洗血管内血液，取脑称量，脑组织放于甲酰胺内，于60 ℃下水浴24 h，匀浆后离心(1 000 r/min、6 min)，于酶标仪635 nm波长处检测上清液吸光度值，计算EB含量。EB含量越高，血-脑脊液屏障通透性越强。

2结果

PI3K、AKT 、Caspase-3蛋白均位于胞质上，阳性表达呈棕黄色物质沉积。各组脑组织中PI3K、AKT、Caspase-3蛋白表达水平及脑组织凋亡细胞数、含水量、血-脑脊液屏障通透性比较见表1。

表1　各组脑组织PI3K、AKT、Caspase-3蛋白表达水平及凋亡细胞数、含水量、EB含量比较±s)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。 3讨论

PI3K/AKT信号转导通路作为细胞生存的信号通路之一，其在细胞增殖、分化，抑制神经细胞凋亡方面起到了重要的作用[4]。脑出血后，机体本身可以释放出一些能够将具有酪氨酸激酶活性受体激活的物质，受体经过其磷酸化以后会特异性地结合PI3K的调节亚基，从而将PI3K激活；PI3K激活后可使细胞膜上的肌醇发生磷酸化，生成第二信使[5，6]。AKT的激活需要依赖Ser473的磷酸化，AKT磷酸化激活后即成为p-AKT。p-AKT通过直接将其下游凋亡靶蛋白磷酸化或者间接改变、编码凋亡相关蛋白的基因表达来实现脑保护作用。总之，PI3K/AKT信号通路激活后，能够作用于Bcl-2、Caspase-3为下游凋亡靶蛋白，通过激活或抑制其表达来发挥生物学效应。银杏叶片治疗脑出血疗效肯定且安全，其作用已得到学术界公认，常被用作实验的对照药物。本研究也以银杏叶片作为阳性对照药，结果显示补阳还五汤与银杏叶片的作用相当，补阳还五汤能够更好地将该信号转导通路激活，发挥脑保护作用。补阳还五汤组大鼠脑组织PI3K、AKT蛋白表达升高，细胞凋亡数量减少，与李峰等[7]研究结果一致，提示补阳还五汤可抑制神经细胞凋亡，该作用与PI3K/AKT信号通路的激活密不可分。

细胞凋亡的最终解释是Caspase-3激活所致，若Caspase-3表达增强，则细胞凋亡加剧；反之，则可以产生较明显的神经保护作用[8~11]。作为凋亡信号上游因子的Caspase-3，其表达增强后能够与其下游凋亡靶基因相互作用，使神经系统受损[12]。脑出血损伤中，有效抑制Caspase-3的激活，能够减少神经细胞凋亡，对脑出血发挥治疗和保护脑组织作用。Caspase-3的表达很大程度上也受到PI3K/AKT信号通路的影响，PI3K/AKT信号通路的激活能够间接抑制凋亡执行蛋白Caspase-3及其下游凋亡靶基因的级联反应，起到脑保护作用[13，14]。本研究中补阳还五汤组Caspase-3蛋白表达水平低于模型组，提示补阳还五汤可通过激活PI3K/AKT信号通路调节凋亡调控蛋白Caspase-3表达变化。

血-脑脊液屏障通透性破坏引发的脑水肿对于迟发性神经细胞损伤和凋亡有促进作用，加重细胞功能障碍和坏死[8]。本研究发现，与模型组比较，补阳还五汤组大鼠脑组织血-脑脊液屏通透性降低，脑水肿减轻，可见补阳还五汤发挥了较好的脑保护作用。

综上所述，补阳还五汤提取物能够激活PI3K/AKT信号转导通路，降低大鼠血-脑脊液屏通透性，下调Caspase-3蛋白表达来实现减轻脑水肿、抑制细胞凋亡的生物学效应。然而补阳还五汤提取物激活PI3K/AKT信号通路后是否也能介导其他凋亡因子发生改变尚不明确；同时，信号转导通路众多，其是否能够激活其他重要的通路仍未可知，需进一步研究证实。

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(收稿日期：2015-09-10)

中图分类号：R743.34

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)09-0029-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.010

通信作者：吴晓光(E-mail:ewxg@qq.com)

基金项目：河北省高等学校重点学科病理生理学项目资助(2013)。