黄媛恒，谢剑，黄创明，韦仙琴，林心媚，刘芳铭，李映新

(1广西医科大学基础医学院，南宁 530021；2广西医科大学药学院)



红景天苷体外灌流对大鼠心肌细胞膜钠通道电流的影响

黄媛恒1，谢剑1，黄创明1，韦仙琴1，林心媚1，刘芳铭1，李映新2

(1广西医科大学基础医学院，南宁 530021；2广西医科大学药学院)

摘要：目的观察红景天苷体外灌流对SD大鼠心肌细胞膜钠通道电流(INa)的影响。方法 SD大鼠颈部脱臼处死后，开胸剪断主动脉并取下心脏，采用Langendorff 逆行主动脉灌流法急性分离SD大鼠单个心室肌细胞，置于培养皿，以电极外液灌流冲洗。置入微电极，充灌电极内液，采用全细胞模式的膜片钳技术检测INa，电流稳定后灌注红景天苷100 μmol/L，再次检测INa。绘制电流-电压关系(I-V)曲线、稳态激活曲线及稳态失活曲线，观察灌流前后大鼠心肌细胞INa及相关曲线的变化。结果红景天苷灌流后INa幅值增加。红景天苷灌流后INa I-V曲线下移，但不改变I-V曲线形状、最大激活电位和反转电位。红景天苷灌流前后INa密度最大峰值分别为(-29.71±4.37)、(-58.66±8.21)pA/pF，灌流前后相比，P<0.05。红景天苷灌流前后INa稳态失活曲线的半数失活电压分别为(-66.67±1.57)、(-61.45±1.57)mV，半数失活电压向正值方向移动，斜率因子分别为-10.23±1.30、-7.71±1.12，灌流前后半数失活电压相比，P<0.05。红景天苷灌流前后INa稳态激活曲线半数激活电压差异无统计学意义。结论 红景天苷体外灌流可使SD大鼠心肌细胞膜INa的I-V曲线下移，增加电流幅值，该作用可能与红景天苷增加钠通道失活电位、抑制电流失活有关。

关键词：红景天苷；心肌细胞；细胞膜离子通道；钠通道；钠通道电流；全细胞膜片钳技术；动物实验

红景天是景天科景天属多年生草本植物，有益气活血、通脉止痛功效[1]，其主要活性成分为红景天苷。研究[2~8]发现，红景天苷具有抗氧化应激、改善微循环、增加缺血-再灌注心脏冠脉血流量、增强心肌收缩力、抗心律失常、改善缺血心肌功能等多种作用。心肌细胞电生理异常是心肌缺血-再灌注损伤及再灌注后心律失常发生的分子机制之一。红景天苷可抑制心肌缺血损伤后动作电位幅度下降，推测此作用与钠通道电流(INa)的增加有关，但尚未经实验证实。2015年1~8月，我们分离大鼠心肌细胞，体外给予红景天苷灌流，观察灌流前后INa变化，现报告如下。

1材料与方法

1.1实验动物与材料SPF级SD大鼠6只，雌雄不限，体质量(200±20)g，由广西医科大学实验动物中心提供。红景天苷(上海源叶生物科技有限公司，批号20131121，HPLC≥98%)，Ⅱ型胶原酶、MgAIP、EGTA(Sigma公司)，BSA(Gibico公司)(Sigma公司)，HEPES(Amresco公司)，其余试剂为国产分析纯。无钙台氏液(mmol/L)：NaCl 136，KCl 5.4，MgC12·6H2O 1.0，NaH2PO4·2H2O 0.33，HEPES 10，Glucose 10，用NaOH调至pH 7.4。消化液为含Ⅱ型胶原酶10 mg、BSA 10 mg的无钙台氏液(30 mL)。KB液(mmol/L)：KOH 70，KCl 40，KH2PO420，MgC12·6H2O 3.0，HEPES 10，Tauringe 20，EGTA 0.5，L-glutamic acid 50，Glucose 10，用KOH调至pH 7.4。电极外液(mmol/L)：NaCl 20， CsCl 120，MgCl21，CaCl20.5，Glucose 10，HEPES 10，用CsOH调至pH 7.4；电极内液(mmol/L)：NaCl 5， CsCl 20，CsF 110，MgCl21，HEPES 5，EGTA 5，MgATP 5，用CsOH调至pH 7.2。EPC10放大器(HEKA公司)，P-97拉制仪(Sutter公司)，玻璃电极(武汉微探科学仪器有限公司)。

1.2心肌细胞分离大鼠颈部脱臼处死，迅速开胸，剪断主动脉并取下心脏，按主动脉逆行插管将心脏挂于Langendorff装置灌流，流速8 mL/min，灌流液持续通氧并保持出口处37 ℃恒温。以无钙台氏液灌流至流出液澄清，再用消化液灌流至心脏松软，即刻剪取心室部分组织于KB液中吹打并过200目筛网，过滤液自然沉降后弃上清液，加入新鲜KB液复悬，于-4 ℃冰箱保存，用于膜片钳实验。

1.3红景天苷灌流方法及心肌INa检测吸取心肌细胞悬液于培养皿中静置，待细胞贴壁后，用电极外液灌流冲洗5 min，流速1.5 mL/min。微电极经拉制仪三步拉制而得，充灌电极内液后电阻为2~5 MΩ，采用全细胞模式的膜片钳技术记录INa。采用保持电位为-90 mV、指令电压为-120~+25 mV、时程为50 ms、阶跃为5 mV的刺激程序引出一内向电流，该电流能被30 μmol/L河豚毒素阻断，证实为INa。待电流稳定后，以相同流速转换含100 μmol/L红景天苷的电极外液灌流冲洗细胞5 min。通过Pulsefit软件进行数据转换输出。

1.4INa相关曲线的绘制分别于红景天苷灌流前后绘制相关曲线。①采用Sigmaplot软件绘制电流-电压关系(I-V)曲线。②稳态激活曲线由I-V曲线数据转换成膜电导并作图获得；用Boltzmann方程G/Gmax=1/{1+exp[-(V-V1/2)/k]}对曲线进行拟合，其中G为各个电压下的膜电导，Gmax为最大膜电导，V1/2为半数激活电压，k为斜率因子。③由双脉冲刺激获得稳态失活曲线；双脉冲刺激参数：保持电位-90 mV，先给-120~+30 mV、阶跃为10 mV、时程为50 ms的条件脉冲，然后紧跟一去极化至10 mV、持续时间10 ms的测试脉冲；用Boltzmann方程I/Imax=1/{1+exp[(V-V1/2)/k]}对激活曲线进行拟合，其中I为测试脉冲引出峰电流值，V1/2为半数失活电压，k为斜率因子。

2结果

2.1红景天苷灌流前后大鼠心肌细胞INa及I-V曲线变化红景天苷灌流后INa幅值增加。红景天苷灌流后INa I-V曲线下移，但不改变I-V曲线形状、最大激活电位和反转电位。灌流前INa的电流密度在膜电位-40 mV达到最大峰值[(-29.71±4.37)pA/pF]，灌流后电流密度最大峰值为(-58.66±8.21)pA/pF，灌流前后电流密度最大峰值相比，P<0.05。见图1。

2.2红景天苷灌流前后大鼠心肌细胞INa稳态激活曲线变化红景天苷灌流前后INa稳态激活曲线V1/2分别为(-54.90±0.18)、(-53.66±0.21)mV，k分别为2.30±0.17、2.84±0.19，灌流前后V1/2相比，P>0.05。见图2。

图1　红景天苷灌流前后INa I-V曲线变化

图2　红景天苷灌流前后INa稳态激活曲线变化

2.3红景天苷灌流前后大鼠心肌细胞INa稳态失活曲线变化红景天苷灌流前后INa稳态失活曲线V1/2分别为(-66.67±1.57)、(-61.45±1.57)mV，V1/2向正值方向移动，k分别为-10.23±1.30、-7.71±1.12，灌流前后V1/2相比，P<0.05。

图3　红景天苷灌流前后INa稳态失活曲线变化

3讨论

缺血-再灌注损伤可使心肌细胞各种离子通道和离子交换体的功能平衡被打破，导致心肌细胞离子浓度和能量失衡，刺激心室结构重塑和功能改变[9]。研究[10]发现，大鼠心肌细胞缺氧时INa减小，复氧后INa进一步降低。另有研究[11~15]表明，缺氧可使INa减小，随着缺氧时间延长，钠通道的激活和失活时间也延长，再灌注后虽然INa激活时间恢复较快，但失活时间并不立即恢复。快钠通道活性的降低使钠离子快速内流受阻，心肌兴奋性降低、兴奋性恢复时间延长，细胞静息电位下降可降低动作电位0相除极上升速度，导致冲动传导减慢，继而引起心肌细胞各种离子通道功能异常，易诱发折返性心律失常[16]。

红景天苷是高原藏药红景天的主要活性成分。红景天苷可明显提高缺氧/复氧和氧化损伤的心肌细胞存活率，降低培养液中LDH、CK水平[17]；还能改善急性血瘀模型大鼠的血液流变学，增加缺血-再灌注后大鼠离体冠脉血流，增强心肌收缩力[2~5]。多项研究[6~8]表明，红景天苷还有防治心律失常的作用，能通过不同途径对心肌缺血-再灌注损伤进行干预。红景天苷可抑制心肌缺血损伤后动作电位幅度下降和动作电位复极时间缩短。

本研究采用膜片钳技术记录大鼠心肌细胞INa，并给予红景天苷灌流，结果发现，红景天苷灌流后INa幅值增高，I-V曲线下移，但不改变I-V曲线的基本形状，提示红景天苷在不同膜电位水平对INa的作用是一致的。红景天苷对INa激活的影响并不明显，但能使INa失活曲线右移、增大失活电压、减慢稳态失活过程。由此推测，红景天苷对INa的增强作用或与减慢其失活过程有关。INa幅值增加可对抗心肌缺血损伤后动作电位幅度下降，改善缺血-再灌注后心肌细胞快钠通道活性，调节Na+-Ca2+交换体功能，使钙外排减少，产生强心作用，这些可能是红景天苷抗心律失常、保护缺血-再灌注心肌的分子机制。

参考文献：

[1] 杨卓,龙旭,兰泽伦,等.圣地红景天研究进展[J].现代临床医学,2011,37(4):243-244.

[2] 颜天华,杜保生,杨伟,等.红景天苷对大鼠血液流变学和离体心脏缺血-再灌注损伤的影响[J].中国天然药物,2008,6(3):219-222．

[3] 高元峰,陈兴,陈里新,等.红景天苷对大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤的保护作用及机制研究[J].中南药学,2010,8(2):115-118.

[4] 宋斌,黄山杉,刘庆国,等.红景天苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].辽宁中医杂志,2005,3(2):256-258．

[5] 朱宁,张拮,孙莉,等.红景天苷对缺氧诱导培养乳鼠心肌细胞的保护作用[J].中成药,2012,34(8):1587-1589．

[6] 胡敏,于金德.红景天苷对心血管系统作用的研究[J].国外医学：心血管疾病分册,2003,30(5):298-300.

[7] Maimeakulova LA, Maslov LN, Lishmanov IUB, et al. The participation of the mudelta and kappa-opioid receptors in the realization of the anti-arrhythmia. effect of Rhodiola rosea[J]. Eksp Klin Farmakol, 1997,60(1):38-39.

[8] Maimeakulova LA, Maslov LN. The anti-arrhythmia action of and Rhldiola roses and of n-tyrosol in modes of experimental arrhythmia[J]. Eksp Klin Farmakol, 1998,61(2):37-40.

[9] Askenasy N, Navon G. Volume-related activities of sodium ion transporters: multinuclear NMR studies of isolated rat hearts [J]. Am J Physiol, 1996,271(1 Pt2):H94-102.

[10] 丛恬駪,张铭慧,何海燕,等.牛磺酸镁对缺氧/复氧致大鼠心室肌细胞钠离子通道异常的影响[J].中国药理学通报,2014,30(10):1382-1387.

[11] 邹路芸,蒋文平.缺血/再灌注对心室肌细胞膜离子通道的影响[J].中国心脏起搏与心电生理杂志,1999,13(4):230-233．

[12] 刘晓云,丁超,张霞.缺血/再灌注对大鼠心室肌细胞钠离子电流的影响[J].中国临床康复,2005,9(47):28-29．

[13] Liu XY, Ding C, Zhang X. Effect of ischemic-reperfusion on sodium channel current of cardiomyocytes in rats[J]. Chin J Clin Rehabit, 2005,9(47):28-29．

[14] Frhlich GM, Meier P, White SK, et al. Myocardial reperfusion injury: looking beyond primary PCI[J]. Eur Heart J, 2013,34(23):1714-1722．

[15] Goegelein H, Gautier P, Roccon A, et al. Effects of the novel Amiodarone-like compound SAR114646A on cardiac ion channels and ventricular arrhythmias in rats[J]. Naunyn Schmiedeberg′s Arch Pharmacol, 2011,384(3):231-244.

[16] Amin AS, Asghari-Roodsari A, Tan HL. Cardiac sodium channel opathies[J]. P Flugers Arch, 2010,460(2):223-237.

[17] 宁宗,李贻奎,周燕,等.薯截皂苷元活性成分对心肌细胞损伤的保护作用及机制研究[J].中国中西医结合杂志,2010,30(4):407-409.

(收稿日期：2015-10-21)

中图分类号：R285. 5

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)07-0031-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.011

通信作者：李映新(E-mail: marchimoro@yeah.net)

基金项目：广西壮族自治区大学生创新创业训练计划项目(201410598022)。