张鹏，姜万君,2

(1中南大学生殖与干细胞工程研究所，长沙410078；2南昌大学医学院)



韩华

抑制miR-29a表达对体外蜕膜化人子宫内膜基质细胞蜕膜催乳素分泌的影响

张鹏1，姜万君1,2

(1中南大学生殖与干细胞工程研究所，长沙410078；2南昌大学医学院)

摘要：目的观察抑制miR-29a表达对体外蜕膜化人子宫内膜基质细胞蜕膜催乳素(dPRL)分泌水平的影响。方法 收集子宫良性病变患者全子宫切除术中留取的子宫内膜组织，分离子宫内膜基质细胞。取部分细胞分为实验组与对照组，实验组用雌二醇(E2)和孕酮(P4)对细胞进行蜕膜化处理，对照组不进行蜕膜化处理；取部分细胞按2×105/mL接种到6孔板中，分为1、2、3组，1组转染anti-miR-29a，2组转染control miRNA，3组为空白对照；分别于培养0、24、48、72 h后收集各组细胞。采用real-time PCR法检测各组细胞中的miR-29a，采用化学发光法检测各组细胞培养液上清中的dPRL。结果实验组培养0、24、48、72 h细胞中miR-29a相对表达量及细胞培养液上清中dPRL水平高于对照组(P均<0.01)；实验组随培养时间延长，miR-29a表达逐渐上调，培养液上清中dPRL水平增高，各培养时点两两相比，P均<0.05。培养24、48、72 h时1组细胞中miR-29a相对表达量低于2、3组，细胞培养液上清中dPRL水平低于2、3组(P均<0.01)。结论 抑制miR-29a表达后，蜕膜化人子宫内膜基质细胞分泌dPRL减少；miR-29a可能参与了子宫内膜基质细胞的蜕膜化过程，并调控子宫内膜基质细胞分泌dPRL。

关键词：微小RNA-29a；蜕膜催乳素；人子宫内膜基质细胞

子宫内膜蜕膜化是指子宫内膜基质细胞受到蜕膜化诱导因子的调节发生增生、分化，对胚胎着床及妊娠建立有重要作用[1~4]。近年来发现miR-29a在子宫内膜癌患者的子宫内膜组织中高表达，并受雌、孕激素调节[4~9]，但miR-29a对子宫内膜基质细胞分化及蜕膜化过程中催乳素(PRL)表达的调控作用尚不明确。2015年2~7月，我们观察了抑制miR-29a表达对体外蜕膜化人子宫内膜基质细胞分泌蜕膜催乳素(dPRL)水平的影响，为研究miR-29a在子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中的作用奠定理论基础。

1材料与方法

1.1标本与试剂收集子宫良性疾病患者手术切除的正常子宫内膜组织。患者年龄24~43岁，月经周期规律，无全身系统疾病，术前3个月内未服用激素类药物。胰蛋白酶、TRIzol试剂盒购自Invitrogen公司，Ⅱ型胶原酶、17-β雌二醇(E2)、孕酮(P4)购自Sigma公司，无酚红DMEM/F12培养基和FBS购自北京Solarbio公司，real-time PCR试剂盒及逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，抗miR-29a、抗miR对照购自Santa Cruz公司，dPRL化学发光检测试剂购自德国拜耳公司。

1.2子宫内膜基质细胞分离培养及鉴定参照文献[3，8]方法无菌刮取子宫内膜组织，置于含青霉素和链霉素的PBS缓冲液中；吹打均匀后离心，用眼科剪将组织剪碎至1 mm3，再次离心后加入0.25%胰酶，分别于4 ℃和37 ℃条件下各消化1 h；加入FBS，终止消化后用PBS溶液冲洗2~3次后离心，去上清；在下层沉淀液中加入5 g/LⅡ型胶原酶，放37 ℃培养箱消化30 min。将细胞悬液经过二次滤网分离基质细胞，用细胞培养液重悬浮细胞，以2×105/mL接种于细胞培养皿中，置入37 ℃、5% CO2培养箱中培养，隔天更换1次培养液，原代培养4~5 d，用0.25%胰酶消化后传代。选择传至第4代的子宫内膜基质细胞，进行细胞爬片培养，待细胞占玻片80%左右时取出，分别加入一抗和二抗，37 ℃孵育1 h，以0.01 mg/mL 碘化丙啶(PI)37 ℃复染细胞核5~10 min，甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察，基质细胞呈多边形或梭形。

1.3子宫内膜基质细胞的蜕膜化处理取传代至第4代、纯度达到90%的子宫内膜基质细胞，分为实验组和对照组。实验组继续培养，待细胞生长融合度达80%，换含10 nmol/L的E2、1 μmol/L的P4及10%FBS无酚红DMEM/F12培养基培养。对照组待细胞生长融合度达80%，换含10%FBS无酚红DMEM/F12培养基培养。分别于培养0、24、48、72 h取两组细胞。

1.4anti-miR-29a转染子宫内膜基质细胞转染前1 d消化收集基质细胞，并按2×105/mL接种到6孔板中，每孔1 mL，待细胞达到80%融合时，将细胞分为1、2、3组。1组转染anti-miR-29a，2组转染control miRNA，3组为空白对照。将细胞于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h后换正常培养液培养。分别于培养0、24、48、72 h收集各组细胞。

1.5子宫内膜基质细胞中miR-29a检测采用real-time PCR法。反应条件为95 ℃ 30 s，预变性94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。以2-ΔΔCt代表基因相对表达量。

1.6细胞培养液上清中dPRL检测取实验组、对照组、1组、2组、3组细胞培养液，800 r/min离心5 min，去除细胞碎片，收集上清。采用化学发光法检测dPRL，每组实验重复3次。

2结果

2.1实验组与对照组细胞中miR-29a表达及培养液上清中dPRL水平比较实验组培养0、24、48、72 h细胞中miR-29a表达量及细胞培养液上清中dPRL水平高于对照组(P均<0.01)；实验组随培养时间延长，miR-29a表达逐渐上调，培养液上清中dPRL水平增高，培养各时点两两相比，P均<0.05。见表1。

表1　实验组与对照组细胞中miR-29a表达及培养液上

注：与对照组同时点相比，*P<0.01；与同组培养0 h时相比，#P<0.05；与同组培养24 h时相比，△P<0.05；与同组培养48 h时相比，☆P<0.05。

2.21、2、3组细胞中miR-29a表达及培养液上清中dPRL水平比较1组培养24、48、72 h细胞中miR-29a相对表达量低于2、3组，细胞培养液上清中dPRL水平低于2、3组(P均<0.01)。见表2。

表2　1、2、3组细胞中miR-29a表达及培养液上清中

注：与1组同时点相比，*P<0.01。

3讨论

胚胎着床的重要前提是子宫内膜发生蜕膜化，即子宫进入容受状态，此过程涉及到子宫内膜基质细胞的增殖分化[1,8,9]。miRNA是基因表达、修饰、转录和翻译的调节分子，通过与靶mRNA特异性结合，导致靶mRNA降解或抑制其翻译[10~13]。miR-29是新近发现的与纤维化疾病有关的小分子RNA家族。人类miR-29包括miR-29a、miR-29b1、miR-29b2和miR-29c[5,7]。近年来研究[6,13]发现，miR-29a在雌鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化的形成及早期妊娠的建立中发挥重要的调节作用，而且在E2、P4共同诱导的大鼠子宫内膜基质细胞体外蜕膜化过程中表达上调。

鉴于伦理学方面考虑，无法在体进行蜕膜化及胚胎植入分子调控机理的研究，所以我们分离人子宫内膜基质细胞在体外进行蜕膜化诱导，观察miR-29a对人子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中dPRL分泌水平的影响。本研究结果显示，实验组培养0、24、48、72 h细胞中miR-29a相对表达量及细胞培养液上清中dPRL水平高于对照组；实验组随培养时间延长，miR-29a表达逐渐上调，培养液上清中dPRL水平增高；1组细胞培养24、48、72 h时miR-29a相对表达量低于2、3组，细胞培养液上清中dPRL水平低于2、3组。上述结果说明，人子宫内膜基质细胞中miR-29a表达量随着蜕膜化时间的延长逐渐上升，且细胞分泌dPRL水平随蜕膜化时间的推进而逐渐增高；miR-29a表达下调后，蜕膜化标志分子dPRL的分泌水平也相应下调；miR-29a可能参与了子宫内膜基质细胞体外蜕膜化过程，并调控子宫内膜基质细胞分泌dPRL。对于相关信号通路及具体机制，还有待进一步探索。

参考文献：

[1] Ramathal CY, Bagchi IC, Taylor RN, et al. Endometrial decidualization: of mice and men[J]. Semin Reprod Med, 2010,28(1):17-26.

[2] Zhang YY, Chen H, Sun C, et al. Expression and functional characterization of NOD2 in decidual stromal cells isolated during the first trimester of pregnancy[J]. PLoS One, 2014,9(6):e99612.

[3] 张群,刘红玉,蒋玥,等.miR-181a促进人子宫内膜间质细胞蜕膜化催乳素的表达[J].医学研究生学报,2012,25(2):129-134.

[4] O′connell RM. Endogenous miR-29a regulates HSC function in mammals[J]. Blood, 2015,125(14):2180-2181.

[5] Qiu F, Sun R, Deng N, et al. miR-29a/b enhances cell migration and invasion in nasopharyngeal carcinoma progression by regulating SPARC and COL3A1 gene expression[J]. PLoS One, 2015,10(3):e0120969.

[6] Xia HF, Jin XH, Cao ZF, et al. MicroRNA expression and regulation in the uterus during embryo implantation in rat[J]. FEBS J, 2014,281(7):1872-1891.

[7] Li H, Solomon E, Duhachek Muggy S, et al. Metalloprotease-disintegrin ADAM12 expression is regulated by Notch signaling via microRNA-29[J]. J Biol Chem, 2011,286(24):21500-21510.

[8] Zhang P, Tang M, Zhong T, et al. Expression and function of kisspeptin during mouse decidualization[J]. PLoS One, 2014,9(5):e97647.

[9] 刘杰,尹秋萍,黄凯,等.转录因子C/EBP-β促进人子宫内膜基质细胞蜕膜化进程[J].中国妇幼保健,2014,29(5):739-743.

[10] Li J, Wan X, Qiang W, et al. MiR-29a suppresses prostate cell proliferation and induces apoptosis via KDM5B protein regulation[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(4):5329-5339.

[11] Wang H, Dey SK. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models[J]. Nat Rev Genet, 2006,7(3):185-199.

[12] Takahashi H, Kutasy B, Pes L, et al. Decidual beta-carotene-15,15′-oxygenase-1 and 2 (BCMO1,2) expression is increased in nitrofen model of congenital diaphragmatic hernia[J]. Pediatr Surg Int, 2015,31(1):37-43.

[13] Zhou J, Xiao XM, Wu YH. Expression of interferon-gamma in decidual natural killer cells from women with hypertensive disorder complicating pregnancy[J]. J Obstet Gynaecol Res, 2014,40(3):670-676.

Effect of inhibiting miR-29a expression on prolactin secretion of human endometrial stromal cells during in vitro decidualization

ZHANGPeng1,JIANGWanjun

(1InstituteofReproductive&StemCellEngineering,CentralSouthUniversity,Changsha410078,China)

Abstract:Objective To observe the effect of inhibiting miR-29a expression on prolactin secretion of human endometrial stromal cells (HESCs) during in vitro decidualization. MethodsWe collected the endometrial tissues during panhysterectomy from patients with uterine benign lesions, and used trypsin method to isolate HESCs. The cells were then divided into the experimental group and control group, the experimental group was treated with estradiol (E2) and progesterone (P4), and the control group was not treated. We took part of the cells in 2×105/mL to inoculate into the 6-well plates and and then divided them into groups1, 2 and 3. The group 1 was transfected by anti-miR-29a. Group 2 was transfected by Control-miRNA and group 3 as taken as the blank control. After being cultured for 0 h, 24 h, 48 h, 72 h we collected cells in each group. real-time PCR was used to detect miR-29a in the cells of each group. dPRL in the supernatant of cell culture medium was detected by chemiluminescence method. ResultsThe relative expression of miR-29a in the cells after being cultured for 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, and the dPRL level in the cell culture supernatantthe of the experimental group were higher than those of the control group (all P<0.01). In the experimental group, with the prolonged culture time, the miR-29a expression was gradually increased, and the level of dPRL in the culture supernatant was increased. Significant difference was found between every two time points (all P<0.05). The relative expression of miR-29a in the group 1 at 24 h, 48 h and 72 h was lower than that in the groups 2 and 3, and the level of dPRL in the supernatant of group 1 was lower than that in the groups 2 and 3 (all P<0.01). ConclusionsAfter the inhibition of miR-29a expression, human decidual endometrial stromal cells reduce the secretion of dPRL. miR-29a may be involved in the decidual process of HESCs, and regulates the endometrial stromal cells secreting dPRL.

Key words:microRNA-29a; decidual prolactin; human endometrial stromal cells

(收稿日期：2015-09-28)

中图分类号：R711.51；R321.3

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)07-0001-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.001

通信作者简介：姜万君(1993-)，女，学士，主要研究方向为生殖内分泌。E-mail: 18270916871@163.com

作者简介：第一张鹏(1986-)，男，在读博士，主要研究方向为人类辅助生殖技术。E-mail: zhangpengszyx@csu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31260248)。

·论著·