顾立学，孙伟明（辽宁医学院附属第一医院普外乳甲整形病区，辽宁锦州121000）



MicroRNA-539靶向膜相关的鸟苷酸激酶蛋白1抑制甲状腺癌细胞的侵袭与迁移

顾立学，孙伟明
（辽宁医学院附属第一医院普外乳甲整形病区，辽宁锦州121000）

摘要：目的观察microRNA-539（miR-539）的表达对甲状腺癌细胞侵袭与迁移的影响，探究miR-539与膜相关的鸟苷酸激酶蛋白1（CARMA1）在甲状腺癌中相互作用的机制。方法构建miR-539与CARMA1高表达及低表达的细胞模型后通过transwell及MTT法检测两种不同的甲状腺癌细胞的侵袭、迁移及增殖能力。Western blot及RT-PCR检测细胞中蛋白及mRNA表达。结果miR-539抑制甲状腺癌细胞的侵袭与迁移。通过荧光素酶报告检测发现miR-539通过靶向CARMA1的3’-UTR端从而起到抑制甲状腺癌中CARMA1的作用。进一步的研究证实，CARMA1可显著促进甲状腺癌细胞的侵袭与迁移。而调节CARMA1的表达，miR-539随之变化。研究还发现，与对照组比较，甲状腺癌中miR-539的表达量降低而CARMA1的表达量增加。结论miR-539靶向CARMA1抑制甲状腺癌细胞的侵袭与迁移。

关键词：甲状腺癌；microRNA-539；CARMA1

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，近十年来其发病率逐年递增[1]。miRNAs是一类天然的保守的非编码小分子RNA，它通过与靶基因mRNA碱基配对来控制大量基因的表达，从而达到裂解、转化mRNA的效果[2]。最近的研究表明，多种miRNA对甲状腺癌的发生发展起作用[3-5]。但其具体的作用机制目前尚无研究报道，为了探寻其作用机制，笔者设计了以下实验。

1　资料与方法

1.1一般资料

收集2010年2月-2015年2月于辽宁医学院附属第一医院就诊并经病理证实的甲状腺癌标本共44例。标本离体时间不超过30 min，将标本一分为二，一部分送病理科，并经病理证实，另一部分离体30 min内冻存于液氮中。所有患者均未接受过任何形式的术前新辅助治疗。

1.2实验方法

1.2.1实验试剂、细胞培养及转染miRNA类似物及抑制物（均购自美国Ambion公司），膜相关的鸟苷酸激酶蛋白1（CARD domain and MAGUK domain-containing protein-1，CARMA1）及β-actin抗体（购于美国Sigma公司），甲状腺癌细胞【中国典型培养物保藏中心（CCTCC）】，置于DMEM培养基中培养，K1及WRO细胞按说明书经脂质体3000试剂转染（购自美国Invitrogen公司）。

1.2.2细胞迁移及侵袭性分析通过transwell小室实验分析细胞的迁徙及进展能力。转染细胞经胰蛋白酶/EDTA处理后在含血清的DMEM培养基中洗1次，将细胞浓度于无血清的DMEM培养基中调整至1×105并接种于下室中。除此之外，在侵袭实验中笔者在小室的过滤器上涂上1次45μg的基质胶。孵育48 h后，用棉签擦去上室中的细胞。收集下层细胞并用结晶紫染色30 min，漂洗后计数细胞。实验重复3次。

1.2.3核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取及实时定量PCR检测按说明书操作，TRIzol法提取组织及细胞中的总RNA并进行反转录。采用实时定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法，TaqMan试剂盒按说明书进行操作。U6 snRNA作为内参。

1.2.4RNA转染靶向CARMA1的RNAi质粒（购自美国Origene公司）。

1.2.5四唑盐比色法（MTT法）采用MTT实验分析细胞增殖能力。细胞接种于96孔板，每孔5×103个细胞。孵育24 h后进行上机检测。实验重复3次。

1.2.6Western blot分析放射免疫分析法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液中裂解细胞提取蛋白，BCA（bicinchonininc acid）法测蛋白浓度。采用浓度为12%凝胶进行电泳，电泳后蛋白转至硝酸纤维素膜上，封闭2 h后上机检测。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0进行配对t检验。所有实验结果均至少重复3次。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1miR-539抑制甲状腺癌细胞的迁移与侵袭

为了探寻miR-539对甲状腺癌细胞的作用，笔者合成了1个双链的miR-539类似物及1个互补的单链miR-539抑制物，并将它们转染至K1甲状腺癌细胞中。采用transwell实验来检测转染细胞的迁移及侵袭能力。结果表明，与对照组比较，转染了miR-539类似物的细胞迁移能力明显下降。相反，转染了miR-539抑制物的细胞迁移能力则明显高于对照组。侵袭能力实验得出的结果与此相同。此外，笔者在WRO甲状腺癌细胞中也进行了此项实验，结果与K1细胞相同。此后，笔者检测了甲状腺癌细胞的增殖能力，MTT实验结果显示，K1细胞及WRO细胞的增殖并不影响miR-539的量。这就表明miR-539是甲状腺癌的1种潜在的肿瘤转移抑制因子。见图1。

2.2miR-539作用于甲状腺癌的靶点为CARMA1

miR-539可以抑制甲状腺癌细胞的转移，因此笔者推断存在1种特定的基因在此过程中起作用。经过计算预测后笔者发现CARMA1的3’UTR端有1个miR-539的结合位点。为了证实笔者的推测，笔者构建了1个野生型的CARMA1的3’UTR端及突变的荧光素酶报告质粒。荧光素酶活性报告显示miR-539类似物可显著阻碍野生型的CARMA1而对突变型则无作用，这就表明miR-539直接作用于此位点。紧接着，笔者检测了miR-539对内源性的CARMA1的表达的影响。在K1细胞中过表达miR-539可显著降低CARMA1的mRNA及蛋白质的表达水平，而抗miR-539的增加CARMA1的表达水平。这就表明miR-539直接靶向并调节CARMA1在甲状腺癌中的表达。见图2。

2.3CARMA1促进甲状腺癌细胞的侵袭与迁移

为了检测CARMA1对甲状腺癌细胞的侵袭与迁移的影响，笔者构建了一系列CARMA1 RNAi的质粒，通过RT-PCR分析显示4#质粒可显著阻止K1细胞中内源性的CARMA1的表达，而1#及2#则不能影响其表达。见图3A。笔者将质粒转染至K1细胞中进行transwell实验，来检测其侵袭及迁移能力。图3B和3C中所示，4#质粒可显著降低K1细胞的侵袭及迁移能力。相反，过表达CARMA1可促进K1细胞的侵袭及迁移。综上所述，CARMA1参与甲状腺癌细胞的侵袭及迁移。

2.4miR-539通过靶向CARMA1阻碍甲状腺癌细胞的侵袭与迁移

由于miR-539可阻碍甲状腺癌细胞的侵袭与迁移，而CARMA1是miR-539的靶向基因，那么miR-539是否通过靶向CARMA1从而在甲状腺癌细胞中起作用的。Transwell实验结果表明，过表达CARMA1可降低miR-539对K1细胞的抑制作用。同时，miR-539的类似物及CARMA1的4#RNAi质粒可相互作用。应用miR-539抑制剂后，K1细胞中miR-539/CARMA1信号通路的作用增加。miR-539抑制剂及CARMA1的过表达质粒相互作用可促进K1细胞的侵袭及迁移。相反，当用4#质粒敲除CARMA1时K1细胞的侵袭及迁移能力下降。这些结果均证实了miR-539通过靶向CARMA1从而影响甲状腺癌细胞的侵袭与迁移。见图4。

图1　Transwell实验转染细胞的迁移及侵袭能力

图2　miR-539对内源性的CARMA1的表达的影响

2.5甲状腺癌细胞系及甲状腺癌组织中miR-539 和CARMA1的表达情况

为了确定miR-539和CARMA1在甲状腺癌中的作用，笔者检测了人甲状腺癌细胞系及甲状腺癌组织中miR-539和CARMA1的表达情况。结果示：在所有甲状腺癌细胞系中，与对照组比较miR-539的表达均较低，而CARMA1的表达量均较高。笔者又检测了32例甲状腺乳头状癌及12例甲状腺滤泡状癌组织，结果与细胞系的结果类似，与癌旁正常组织比较，甲状腺乳头状癌及滤泡状癌组织中miR-539表达量低而CARMA1表达量高。miR-539的表达量与CARMA1的表达量有相关性。这些结果进一步证实miR-539和CARMA1密切相关。

图3　Transwell实验检测质粒转染后细胞的侵袭及迁移能力

图4　Transwell实验检测质粒转染后细胞的侵袭及迁移能力

3　讨论

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，近十年来其发病率逐年递增[1]。大多数甲状腺肿瘤起源于滤泡细胞，可分为：高分化癌，低分化癌及未分化癌[6]。高分化癌包括：滤泡状癌和乳头状癌[7]，其预后较好，但总的复发率高达35%[8]。甲状腺未分化癌则较少见，以侵袭性高，预后差，病死率高为特点[9]。

miRNAs是一类天然的保守的非编码小分子RNA，它通过与靶基因mRNA碱基配对来控制大量基因的表达，从而达到裂解、转化mRNA的效果[10]。近年来，越来越多的研究表明小RNAs在细胞的生长、分化、增殖和凋亡过程中起重要的作用[11]。而关于miR-539的研究则较少。有研究表明miR-539通过抑制O-GlcNAcase的表达从而在心脏衰竭的发病过程中起作用[12]。miR-539通过靶向PHB2调节线粒体的活性[13]。最近的研究表明，多种miRNA对甲状腺癌的发生发展起作用[3-5]。笔者构建了miR-539的类似物及抑制物通过生物信息学分析及荧光素酶活性分析证实了CARMA1是miR-539的一个作用靶点。

CARMA1是一种细胞骨架蛋白，在T淋巴细胞和B淋巴细胞中参与NF-κB的激活[14-15]。大量的研究已证实CARMA1在NF-κB信号转导通路中的作用，但CARMA1在癌症中的作用尚无研究证据表明。支架蛋白CARMA1参与TCR所致的淋巴激活过程。刺激CARMA1可激活NF-κB途径的JNK和翻译因子[16]。笔者的研究首次证实了CARMA1在甲状腺癌中起作用，但仍需进一步的实验来探究其深层机制。

笔者的研究旨在探究miR-539及CARMA1对甲状腺癌细胞转移的影响。结果表明miR-539通过靶向CARMA1的3’- UTR端下调甲状腺癌中CARMA1的表达，进而起到抑制甲状腺癌细胞转移的作用。此外，笔者还发现在甲状腺癌细胞及组织中miR-539的水平与CARMA1表达量呈负相关。笔者的研究首次证明了甲状腺癌细胞侵袭及迁移的机制。尽管靶向小RNA的治疗方式仍处于研究中，但笔者的研究为甲状腺癌的靶向治疗提供了新的思路及理论依据，这对甲状腺癌发病机制的探究及靶向治疗有着重要的意义。

参考文献：

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（王荣兵编辑）

miR-539 directly targeting CARMA1 inhibits thyroid cancer cell migration and invasion

Li-xue Gu,Wei-ming Sun
(Department of Breast and Thyroid Surgery,the First Affiliate Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou,Liaoning 121000,China)

Abstract:Objective To observe the impact of miR-539 on the invasion and migration of human thyroid carcinoma,and to investigate the interaction mechanism between miR-539 and caspase recruitment domain-containing membrane-associated guanylate kinase protein 1 (CARMA1).Methods The ability of cells to migrate and invade was assayed using transwell inserts and MTT assay.The expressions of miR-539 and CARMA1 in thyroid cancer cells were detected by Western blot and RT-PCR.Results miR-539 inhibited the invasion and migration of thyroid cancer cells.Luciferase reporter assay confirmed that miR-539 binding to the 3'-UTR region of CARMA1 inhibited the expression of CARMA1 in thyroid cancer cells.Further studies demonstrated that CARMA1 significantly promoted the migration and invasion of thyroid cancer cells.miR-539 changed as the expression of CARMA1 was regulated.Furthermore,the expression of miR-539 decreased while the expression of CARMA1 increased in thyroid cancer cell lines and thyroid cancer tissues compared with controls.Conclusions miR-539 can regulate migration and invasion in human thyroid cancer cells by targeting CARMA1.

Keywords:thyroid cancer; microRNA; CARMA1

收稿日期：2015-11-25

文章编号：1005-8982（2016）06-0045-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.010

中图分类号：R736.1

文献标识码：A