夏玲芝，曹鹏，李晓娥，许涛，Khawar Ali Shahzad，毛源，张厚智，沈传来（.南京金域医学检验所实验诊断部，江苏南京000；.东南大学医学院病原生物学与免疫学系江苏南京0009）



人类白细胞抗原-B等位基因多态性与江苏地区汉族人群2型糖尿病的相关性研究*

夏玲芝1，曹鹏1，李晓娥2，许涛2，Khawar Ali Shahzad2，毛源1，张厚智1，沈传来2
（1.南京金域医学检验所实验诊断部，江苏南京210002；2.东南大学医学院病原生物学与免疫学系江苏南京210009）

摘要：目的探讨人类白细胞抗原（HLA-B）等位基因多态性与江苏地区汉族人群2型糖尿病的相关性。方法采用聚合酶链反应直接测序分型法（PCR-SBT）对118例江苏地区汉族2型糖尿病（T2DM）个体进行HLA-B等位基因分型，计算各等位基因频率和血清型频率，并与中华骨髓库江苏分库汉族志愿者人群（644例和20 248例）进行统计学比较。结果HLA-B*1501的等位基因频率在江苏地区汉族T2DM人群中明显升高（8.90% vs 3.03%，Pc= 0.000，而HLA-B*5801的等位基因频率则明显下降（1.69% vs 8.62%，Pc=0.000，相对应地，HLA-B*15的血清型频率在江苏地区汉族T2DM人群中明显升高（21.18% vs 13.03%，Pc=0.022，2.55，Power=90.15%），而HLA-B*58的血清型频率则明显下降（1.69% vs 8.62%，Pc=0.000，0.07～0.50，Power=91.09%）。结论HLA-B*1501等位基因可能与江苏地区汉族人群2型糖尿病的易感性有关，而HLA-B*5801则可能有保护作用。这些结果首次提示HLA-I类基因多态性可能与中国人群2型糖尿病有关。

关键词：2型糖尿病；HLA-B；等位基因多态性；PCR-SBT

人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）基因定位于第6号染色体短臂6p21.31区，是迄今所知人类多态性最丰富的遗传系统，在不同种族或同一种族不同群体中的等位基因分布有明显的种群特性，也是最能代表个体特异性的遗传物质。其功能主要表现在对机体免疫应答反应的启动和调节控制，与很多疾病的发生发展具有关联性。对各类疾患人群进行HLA基因型别和频率的分析对疾病机制的研究具有重要启示作用。

我国是糖尿病大国，成人中发病率约9%，其中2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）占90%以上。目前认为2型糖尿病是由环境和遗传因素共同作用的代谢紊乱性疾病，不同遗传背景的个体在相同环境中的患病危险性不同。环境因素如高热量饮食、缺乏体力活动等作用于糖尿病易感者使患病率日益升高[1]。多年来，人们利用候选基因关联研究策略和近来的全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出几十个与T2DM相关的基因位点。在中国人群中这些位点与T2DM的风险关系还在进一步验证[2-3]。20多年来关于HLA基因多态性与T2DM的相关性研究在国内外也不断有报道。但绝大多数研究都聚焦于HLADR和DQA1、DQB1等HLA-II类基因与各民族T2DM的关联性研究。比如：美国黑人T2DM与HLA-DR3、DR4有关联[4]；HLA-DRB1*070101在黎巴嫩人和巴林岛人的T2DM中以及HLA-DQB1*0201在黎巴嫩人的T2DM人群中是易感基因[5]；维生素D受体的基因多态性与HLA-DRB1*04共同作用显著增加了沙特阿拉伯人群T2DM的危险性[6]。在中国T2DM人群中HLA-DQA1和DQB1的研究较多，比如云南汉族[7]和彝族[8]，广西汉族[9]和壮族[10]以及新疆维吾尔族[11]与HLA-DQA1的关联；2013年，Ma等[12]报道HLA-DQA1*0301和0501等位基因是中国汉族T2DM的易感基因，而HLA-DQB1*0501是T2DM合并肾病的保护性基因。关于HLA-I类基因，如HLA-A、HLA-B等与T2DM的相关性研究则很少，比如美国亚拉巴马州的非裔妇女的HLA-B41和HLA-DR2升高是T2DM的独立危险因素[13]。中国T2DM中HLA-I类基因的研究尚未见报道。

本课题组在从人血标本中克隆所有频率>1% 的HLA-B等位基因时，有意识地随机选取标本量较多的江苏地区汉族2型糖尿病患者群的118例血液标本，运用聚合酶链反应直接测序分型法（Polymerase chain reaction-sequence based typing，PCRSBT）技术进行HLA-B等位基因分型，在基因水平上初步探讨了江苏地区汉族T2DM人群HLA-B的等位基因多态性分布状况，并发现HLA-B*1501（B*15）和HLA-B*5801（B*58）的等位基因频率和血清型频率与江苏地区汉族健康人群存在显著差异性。尽管研究例数偏少，但这一结果能提示我国糖尿病研究者应重视HLA-I类基因多态性与2型糖尿病间的关联。

1　资料与方法

1.1调查对象

在南京金域医学检验所实验室随机选取江苏地区汉族无亲缘关系的T2DM成人患者血液标本共计118例。其中，男性57例，女性61例，年龄24～94岁，平均（56.3±16.1）岁。所有患者来自江苏省各县、区医院门诊和住院患者，均经当地就诊医院明确诊断为T2DM，符合1999年世界卫生组织推荐的T2DM诊断标准。所有样本采样时的糖化血红蛋白（HbA1c）≥7.0%。

1.2主要实验仪器及试剂

DNA提取试剂盒（北京天根公司），PCR仪（美国BioRad公司），电泳仪（北京六一仪器厂），凝胶成像仪（上海培清公司），高保真DNA聚合酶（诺维赞公司）。

1.3基因组DNA制备

按照DNA提取试剂盒的操作步骤来提取基因组DNA。用紫外分光光度计测定DNA纯度和浓度，A260/280值介于1.6～1.8，调浓度至80 ng/μl左右，-20℃冰箱保存。

1.4特异性PCR扩增

以基因组DNA为模板，用WHO国际组织相容性工作组（International Histocompatibility WorkingGroup，IHWG）推荐的特异性PCR引物（见表1，PF1 和PR1）扩增HLA-B的第2，3外显子，得到长度大约为919 bp的DNA片段。PCR反应条件为：95℃预变性10 min；然后95℃变性15 s，70℃退火15 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃10 min，4℃保存。

1.5PCR产物割胶纯化并测序

用1.2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，之后对919 bp左右的目的片段进行割胶纯化。将纯化后的PCR产物送上海桑尼测序公司，用针对第2，3外显子的特异性测序（见表1，PF2和PR2，PF3和PR3）引物进行双向测序。

1.6PCR-SBT分型

用Seqman软件将每个样本的4个测序结果拼接成一个完整的重叠序列后，用NCBI的dbMHC数据库在线分析工具SBT Input对其进行HLA-B等位基因分型。

1.7统计学方法

通过直接计数法统计出各等位基因的频率，基因频率（GF）=阳性基因数/个体总数×2。利用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，对不同人群间等位基因频率进行2×2列联表批量χ2检验计算P值，当理论频数>1且<5时，采用连续性校正χ2检验，当理论频数<1时，使用Fisher精确概率检验。利用SNP tools for Microsoft Excel软件计算OR （95%CI）和Power值。P值进行Bonferroni多重检验校正，Pc=P×等位基因或血清型的个数。P<0.05认为差异具有统计学意义。

表1　HLA-B基因位点特异性的扩增和测序引物

2　结果

2.1江苏地区汉族2型糖尿病人群中HLA-B等位基因频率的分布

通过对118例江苏地区汉族2型糖尿病个体进行PCR-SBT分型后得到32个HLA-B等位基因（见表2）。其中等位基因频率>5%的等位基因有6种，分别是HLA-B*4601（14.41%），HLA-B*4001（11.86%），HLA-B*1302（10.17%），HLA-B*1501 （8.90%），HLA-B*1301（7.63%）和HLA-B*4403 （5.08%）。这6种等位基因的频率合计为58.05 %，占该人群的大多数；另外，还检测到7种频率<1% 的HLA-B等位基因。由于所检测的病例数和所获得的等位基因数均偏少，因此未对其基因的多态性分布进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验。图1是代表性的PCR电泳图，图2是代表性的PCR产物基因测序图。

图1　HLA-B基因位点特异性PCR产物

2.2与江苏地区健康人群HLA-B等位基因频率的比较

将118名江苏地区汉族2型糖尿病人群的HLA-B等位基因频率与中华骨髓库江苏分库汉族志愿者人群（644例[14]）进行统计学比较。后者644例志愿者的数据是采用与本研究相同的PCR-SBT分型技术获得，所用的PCR引物也是IHWG推荐的标准引物。结果如表2所示：有2个HLA-B等位基因的频率在江苏地区汉族T2DM人群中明显提升，即B*1501（8.90%vs3.03%，Pc=0.000，I=1.80~5.42，Power=98.23%）和B*4402（1.69% vs 0.08%，Pc=0.032，95%CI=2.47~199.42， Power=79.01%）。其中B*1501与T2DM人群呈正相关最为可信，因为它的3个统计分析指标差异都有统计学意义：Pc<0.01，且其95%可信区间的下限>1.5，Power值（统计功效）>80%，高达98.23%。统计显示，有1个HLA-B等位基因的频率在T2DM人群中明显下降，即B*5801（1.69% vs 8.62%，Pc= 0.000，95%CI=0.07~0.50，Power=91.07%），其值95%可信区间的上限≤0.5，Power>80%，与T2DM人群呈负相关较为可信。统计功效（statisticalpower）是假设检验能够正确侦测到真实的处理效应的能力。一般认为，一个研究在Power>80%时才能比较有把握地保证总体中存在的现象可以通过样本检验得到识别，统计结果才比较可靠。本研究中的B*1501和B*5801的基因频率与健康人群的差异性统计Power值均超过90%，提示尽管研究的样本量偏少（118例），但是它们与江苏汉族人群T2DM呈正相关或负相关的统计分析还是可信的。

表2　江苏地区汉族2型糖尿病人群与江苏地区汉族健康人群HLA-B等位基因频率的比较

2.3与江苏地区健康人群HLA-B等位基因血清型频率的比较

图2　杂合子HLA-B*1501/*4001（sample28）基因测序峰图（140-190 bp）

表3　江苏地区汉族2型糖尿病人群与江苏地区汉族健康人群HLA-B血清型（抗原）频率的比较

将118名江苏地区汉族2型糖尿病人群的HLA-B等位基因血清型频率分别与中华骨髓库江苏分库644例[14]和20 248例[15]汉族志愿者人群进行统计学比较。其中20 248例志愿者的数据是通过PCR-SSP和PCR-SSOP技术获得，只能精确到HLA-B等位基因的血清型（抗原型）。与644例中华骨髓库江苏分库的汉族志愿者人群比较（见表3），HLA-B*15血清型的频率在T2DM人群中显著增高（21.18% vs 13.03%，Pc=0.022，1.26~2.55，Power=90.15%）。另外，HLA-B*58血清型的频率在T2DM人群中显著减低（1.69% vs 8.62%,Pc=0.000，95%CI=0.07~0.50，Power=91.09%）。与20 248例中华骨髓库江苏分库的汉族志愿者人群比较（见表4），HLA-B*59血清型的频率在江苏地区汉族T2DM人群中显著提高（1.69% vs 0.2%，P= 0.000，Pc=0.000，Power=98.64%），而B*15血清型的频率也有增高，但Pc值未能<0.05（21.18% vs 14.4%，P =0.003，Pc=0.066，OR=1.60，95%CI=1.17~2.19，Power=83.43%）。另有B*51（Pc=0.022，）和B*58（Pc=0.044，）的频率在T2DM人群中显著降低。

表4　江苏地区汉族2型糖尿病人群与江苏地区汉族健康人群HLA-B血清型（抗原）频率的比较

由于20 248例中华骨髓库江苏分库志愿者的数据是采用非基因测序方法获得，不同于本研究的HLA-B等位基因分型方法，因此在血清型频率的统计中可能有部分误差。但是，B*15和B*59等位基因在T2DM人群中的血清型频率分别在与上述644例和20 248例汉族志愿者人群相比中呈显著性增高，其中B*15血清型频率的显著性增高较为可信；同样B*58在T2DM人群中的血清型频率与上述两个健康人群比较均显著性下降。在HLA-B等位基因频率的比较中，B*1501和B*5801频率在江苏地区汉族T2DM人群中分别显著升高和降低，与血清型频率比较的结果相一致。这些结果提示：HLA-B*1501（B*15）可能是江苏地区汉族人群T2DM的易感基因，而HLA-B*5801（B*58）则可能是保护基因。

3　讨论

HLA基因是目前已知的人类最为复杂的遗传系统。尽管其功能尚未完全清晰，但是它与很多疾病的关联性已被充分证实。1型糖尿病（T1DM）已被证实与HLA基因区域显著关联，可以解释其近40%的遗传易感性，其余基因的作用则较小[16]。2型糖尿病（T2DM）与1型糖尿病的发病机制不同，但都与遗传因素有关。是否HLA等位基因多态性与T2DM相关联尚无定论，但不断有报道。在中国，多个种族的T2DM人群被研究，但都是关于HLA-DQA1和DQB1等位基因关联性的分析。杨红英等[7]先后对云南108例汉族T2DM患者和58例彝族T2DM患者进行研究，发现DQA1*0301、0501是云南汉族T2DM的易感基因，而DQA1*0401是保护基因，DQA1*0302是T2DM合并肾病的易感基因；HLADQA1*0301是云南彝族T2DM的易感基因，DQA1*0601则是保护基因[8]。梁敏等[9]研究了72例广西汉族T2DM患者，发现T2DM组的DQA1*0104等位基因频率明显高于正常对照组（P <0.01，RR=6.51)，DQA1*0401等位基因频率则明显低于正常对照组（P<0.001，RR=0.29）。随后梁杏欢等[10]研究了67例广西壮族T2DM患者，显示HLA-DQA1*0301、0401基因频率明显高于正常对照组，可能为壮族T2DM发病的易感基因。其中DQA1*0401在上海[17]、广西和云南的汉族T2DM研究中则显示可能是保护基因。刘凤霞[11]对73例新疆维吾尔族T2DM的研究显示，HLA-DQA1*0104可能是新疆吐鲁番地区维吾尔族体T2DM的易感基因。2013年，Ma等[12]研究了310例汉族T2DM患者和100例健康者，认为HLADQA1*0301（15.5% vs 8.0%，P <0.01）和0501 （16.6% vs 8.5%，P <0.01）等位基因是中国汉族T2DM的易感基因，而HLA-DQB1*0501是T2DM合并肾病的保护性基因。

本研究采用“金标准”的PCR-SBT分型技术对118例江苏地区汉族的T2DM人群进行了HLA-B等位基因多态性研究，并与同样采用PCR-SBT分型技术获得的江苏地区汉族骨髓捐献者人群（644例）的HLA-B等位基因分布频率[14]进行了统计学比较，发现HLA-B*1501等位基因的频率在T2DM人群中明显升高，而HLA-B*5801的频率则在T2DM人群中显著下降。血清型频率的比较也得出一致的结果。由于研究的病例数偏少，而且对照组数据虽是健康者但非体检人群，目前数据尚不足以证实这2 个HLA-B等位基因与T2DM的关联性，但这一结果对我国糖尿病研究者则是一个提醒：HLA-I类基因的多态性是否与T2DM有关联性值得注意。本研究将继续扩大检测标本量，以进一步明确这一结果的可信性。

HLA-I类基因在人体细胞的表达范围和抗原提呈功能均与HLA-Ⅱ类基因有明显不同。前者表达于除绒毛外滋养细胞外的所有有核细胞表面，提呈内源性抗原，包括来自细胞内的自身抗原、肿瘤抗原、病毒抗原等，介导CD8+T细胞的活化；后者主要表达于巨噬细胞、DC、成熟B细胞以及激活的T细胞和单核细胞表面，提呈外源性抗原，激活CD4+T细胞。HLA某些等位基因与特定疾病的关联性与其在特定人种或人群中的频率高低有关，更与其提呈特定抗原肽的能力强弱有关。T2DM是环境和遗传因素共同作用的结果，其中HLA-I类基因与T2DM的相关性研究很少，目前只报道美国亚拉巴马州非裔妇女的HLA-B41和HLA-DR2升高是T2DM的独立危险因素，未涉及机制探讨[13]。本研究初步显示B*1501和B*5801与江苏地区汉族人群的T2DM有关，其可能提呈的与T2DM有关的优势抗原肽或者其他的非抗原提呈功能等仍待深入研究。

HLA的分型主要经历了两个阶段：HLA血清学分型和基因分型技术。血清学分型法具有便捷、经济、有效等优点，但准确性不高。基因型分型技术主要有PCR-SSOP（序列特异性寡核苷酸探针）、PCR-SSP（序列特异性引物）以及PCR-SBT（直接测序分型）等3种方法。PCR-SBT法是用PCR扩增获得HLA基因座位的DNA片段，然后对DNA测序，根据碱基序列进行分型，比其他分型方法更为准确，称为HLA分型的“金标准”。本文运用PCR-SBT技术以及国际标准的PCR扩增引物对江苏汉族T2DM个体的HLA-B基因座位第2、3外显子进行扩增和测序，分型结果是可信的。本研究在118例T2DM个体中检测到32个HLA-B等位基因。与江苏地区汉族骨髓捐献者人群比较后，初步显示HLA-B*1501（B*15）可能是江苏地区汉族人群T2DM的易感基因，而HLA-B*5801（B*58）则可能是保护基因。

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（张蕾编辑）

Association between HLA-B allelic polymorphism and type 2 diabetes mellitus in Han ethnicity of Jiangsu*

Ling-zhi Xia1,Peng Chao1,Xiao-e Li2,Tao Xu2,Khawar Ali Shahzad2,Yuan Mao1,Hou-zhi Zhang1,Chuan-lai Shen2
(1.Department of Laboratory Medicine,Nanjing KingMed Diagnostics Limited Company,Nanjing,Jiangsu 210002,China; 2.Department of Pathogen Biology and Immunology,Medical School of Southeast University,Nanjing,Jiangsu 210009,China)

Abstract:Objective To explore the association of HLA-B allele polymorphism with type 2 diabetes mellitus (T2DM) in Han ethnicity of Jiangsu region.Methods One hundred and eighteen patients with clinically diagnosed T2DM were examined.HLA-B typing was performed using polymerase chain reaction with sequence -based genotyping (PCR-SBT).The frequency of HLA-B alleles and serotypes in the group with T2DM was compared with that in Han ethnic healthy populations (644 persons and 20248 persons) from Jiangsu branch of Chinese National Marrow Donor Program (CMDP).Results Compared with the healthy donors,there was an increased frequency of HLA-B *1501 (8.90% vs 3.03%,Pc=0.000,statistical power = 98.23%) and a decreased frequency of HLA-B *5801 (1.69% vs 8.62%,Pc= 0.000,95% CI = 0.07-0.50,statistical power = 91.07%) in the group with T2DM.Accordingly,a higher frequency of HLA-B *15 serotype (21.18% vs 13.03%,Pc= 0.022,and a lower frequency of HLA-B*58book=38,ebook=43serotype (1.69% vs.8.62%,Pc= 0.000,= 0.18,95% CI = 0.07-0.50,power = 91.09%) were found in the T2DM group.Conclusions HLA-B*1501 allele may be a marker of susceptibility for T2DM,in reverse,HLA-B*5801 allele is possibly associated with a resistant effect on T2DM in Han ethnicity of Jiangsu region.These data suggest,for the first time,the association of HLA class I genes with the T2DM in Chinese population.

Keywords:type 2 diabetes; HLA-B; allelic polymorphism; PCR-SBT

[通信作者]沈传来，E-mail：chuanlaishen@seu.edu.cn；Tel：13776629706；025-83272454

*基金项目：江苏省科技厅科技支撑计划项目资助（No：BE2012739）

收稿日期：2015-11-04

文章编号：1005-8982（2016）06-0037-08

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.009

中图分类号：R587.1

文献标识码：A