黄冬云　许文景　周　锐　徐兴祥　张旭东

(苏北人民医院老年科，扬州225001)



CD163分子在非小细胞肺癌患者组织中表达及其对肺癌细胞侵袭和增殖的影响

黄冬云许文景①周锐徐兴祥张旭东

(苏北人民医院老年科，扬州225001)

[摘要]目的：探讨非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)患者血浆和肺癌组织中CD163分子表达水平以及对肺癌细胞侵袭和增殖的影响。方法：选取我院35例NSCLC患者为研究组，35例同期体检的健康人群为对照组，采用Real-time RCR检测肺癌患者肿瘤组织和血浆中CD163表达水平；采用小分子干扰RNA(siRNA)抑制MH-2中CD163分子的表达，再与A549共培养，transwell法观察CD163分子对A549侵袭的影响，CCK-8法检测A549增殖的变化。结果：CD163分子在NSCLC患者血浆中的表达水平显著高于正常健康人群，差异具有统计学意义(P<0.05)，在肿瘤组织中的表达显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)；转染后，A549的侵袭和增殖能力显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：CD163在NSCLC患者血浆和肺癌组织中高表达，并可增强肺癌细胞的侵袭和增殖能力。

[关键词]CD163；NSCLC；侵袭；增殖

肺癌是目前世界范围内致死率最高的肿瘤，是最常见的恶性肿瘤之一，预后较差[1]。其中80%是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]，研究发现，NSCLC患者的5年生存率仅为15%，并且复发率很高[3]。目前肺癌的治疗仍以手术切除为主，辅以放疗和化疗。近年来研究证实肺癌组织中的巨噬细胞参与肿瘤的发生、发展和转移[4,5]，此类巨噬细胞被称为肿瘤相关性巨噬细胞(Tumor associated macrophages，TAMs)[6]。CD163分子位于单核巨噬细胞上，富含半胱氨酸重复序列，属于清道夫受体家族[7]。研究表明在乳腺癌、直肠癌和平滑肌肉瘤中CD163高表达巨噬细胞浸润密度与生存期密切相关，是疾病进展、早期复发和转移的预测因子[8]。但CD163分子在NSCLC的发病机制中的作用尚存在一定争议，本文旨在研究CD163分子在NSCLC患者肿瘤组织和血浆中的表达，以及干扰肺癌细胞中CD163分子表达后，对肺癌细胞侵袭及增殖能力的影响，从而对于肺细胞癌的防治和预后的预测提供一定的理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1临床资料选取2014年3月至2015年3月期间，本科室NSCLC手术患者35例为研究组，其中男21例，女14例，年龄24～75岁，平均年龄(49.7±5.4)岁。所有患者术前均未经介入或放化疗等治疗，均接受了肺癌根治性切除术，所有患者术后病理学证实为非小细胞肺癌，且未发现远处转移，排除合并其他慢性病如高血压、糖尿病或其他肿瘤等的患者。同期健康体检人群35例为对照组，其中男23例，女12例，年龄32～73岁，平均年龄(53.6±50)岁。留取肺癌患者和正常健康组外周血2 ml，静置6 h后，离心取上清；于肿瘤组织术中离体30 min内留取肺癌组织及对应癌旁组织，待测。

1.1.2主要试剂肺癌细胞株A549、肺泡巨噬细胞MH-S购自ATCC公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；荧光标记的2′-O-甲基siRNA CD163-FAM、稳定阴性对照siRNA CD163-NC和CD163、GAPDH引物购自上海吉玛生物技术有限公司；RNA提取试剂盒Trizol购于Gibco公司；Real-time PCR试剂盒购自ROCHE公司；抗CD163抗体购自abcam公司；抗β-actin抗体购自SantaCruz公司；羊抗兔二抗购自SantaCruz公司；CCK-8购自上海博谷生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养肺癌细胞株A549、肺泡巨噬细胞MH-S在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，至对数生长期，以1×105个细胞/平皿接种于25 ml培养瓶平皿，置于37℃、5%CO2、95%湿度培养箱，孵育细胞。

1.2.2细胞转染采用脂质体2000(美国Invitrogen公司)对肺泡巨噬细胞MH-S1中CD163 mRNA抑制表达，并以PBS、siRNA CD163-NC作为对照，于48 h后检测其干扰效率。

1.2.3检测指标Real-time PCR检测CD163 mRNA表达水平：将留取的肺癌患者及对照血浆、肿瘤组织和转染后MH-S，依照产品说明书，以GAPDH作为内参，Real-time PCR检测CD163分子的表达水平。CD163引物：正向5′-TGGACTGTGGCGT-GGCTATT-3′，反向5′-TTGGAGACATATTGCTGC-TGCC-3′。 PCR使用ABI公司的7900型号Real-time PCR仪器，结果采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

Western blot检测转染后MH-S中CD163分子蛋白表达水平：肺癌细胞培养至对数生长期，按照蛋白抽提步骤，提取总蛋白；采用BCA法测定总蛋白浓度，经SDS-PAGE 电泳后转移到NC膜上，5% 脱脂奶粉室温封闭1.5 h，TBST 洗涤后，分别加入1∶1 000抗CD163抗体、1∶500抗β-actin抗体，4℃孵育过夜，TBST洗涤后加入1∶5 000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h ，再用TBST 洗涤，化学发光并曝光成像。Weastern blot检测以β-actin条带作为内参，CD163分子条带与其比较，观察CD163分子蛋白表达变化。

细胞迁移实验：将处于对数生长期的A549和MH-S 2种细胞株，按照10∶1的比例，调整细胞密度至4×105个/ml，按0.1 ml/孔加入到24孔板悬挂式transwell(millipore公司)小室的上层，小室下层加入1 ml的含有10%血清的培养液。培养24 h后，对己迁移至小室下层的A549细胞进行计数(随机选取5个视野)。

细胞增殖实验：将处于对数生长期的A549和MH-S 细胞株按10∶1的比例，以50%的汇合率接种至96孔板，每组设置3个复孔，同时设置只含MH-S和不含细胞的空白培养基作为对照，37℃、5%CO2、95%湿度下培养24 h后，分别在培养孔加入10 μl CCK-8溶液；孵育2 h，美国biotek酶标仪(Elx800)检测450nm的吸光值，每孔实测OD值需减去空白对照OD值，取三复孔平均值，记录OD值。

2结果

2.1肺癌患者血浆中CD163 mRNA的表达水平CD163 mRNA在肺癌患者血浆中表达显著高于正常健康人群(表1)，具有统计学意义(t=16.15，P<0.001)，提示了肺癌患者血浆中CD163 mRNA的高表达水平，可能与肺癌的发病密切相关。

2.2肺癌患者组织中CD163 mRNA的表达水平CD163 mRNA在肺癌患者肿瘤组织中表达显著高于对应的癌旁组织(表2)，具有统计学意义 (t=14.53，P<0.001)， 提示了肺癌患者肿瘤组织中CD163 mRNA的高表达水平，可能与肺癌的发生发展和预后转归密切相关。

表1肺癌患者血浆中CD163 mRNA表达水平

Tab.1CD163 mRNA expression level in plasma of patients with lung cancer

GroupsCase(n)CD163mRNAlevelt/PvalueLungcancergroup3512.78±1.89Normalgroup356.89±1.0416.153/0.0001)

Note：Compared with normal group,1)t=16.15，P<0.001.

表2肺癌患者组织中CD163 mRNA表达水平

Tab.2CD163 mRNA expression level in tissue of patients with lung cancer

GroupsnCD163mRNAlevelt/PvalueTumortissue3523.59±2.56Tumoradjacenttissue3516.33±1.4814.534/0.0001)

Note：Comparison with adjacent tissues,1)t=14.53，P<0.001.

图1　转染siRNA CD163后MH-S中CD163分子表达变化Fig.1　Expression of CD163 in MH-S after transfection with CD163 siRNANote: A.CD163 mRNA expression changes in MH-S；B.CD163 protein expression changes in MH-S，*.P<0.001.

2.3肺泡巨噬细胞转染后CD163分子表达水平变化各组CD163分子表达水平如下：PBS组：1.12±0.17，对照组(siRNA-NC)：0.96±0.16，肺泡巨噬细胞MH-S转染siRNA组(siRNA-FAM)：0.09±0.02。 经单因素方差分析，F=549.521，P=0.000； 两两比较显示：肺泡巨噬细胞MH-S转染siRNA CD163后，同对照组相比，CD163 mRNA的表达水平明显下降，LSD-t=25.846，P=0.000(图1A)差异具有统计学意义；CD163分子蛋白表达水平也明显降低(图1B)，提示低表达CD163分子肺泡巨噬细胞构建成功。

2.4肺泡巨噬细胞中CD163对细胞侵袭的影响各组CD163分子对细胞侵袭的影响资料(Cell Count,×104)分别为：PBS组：45.2±3.7，对照组(siRNA-NC)：42.7±3.8，肺泡巨噬细胞MH-S转染siRNA组(siRNA-FAM)：12.5±3.2。 经单因素方差分析，F=776.022，P=0.000； 两两比较显示：肺泡巨噬细胞MH-2转染siRNA CD163后，同对照组相比，transwell小室下层肺癌细胞A549数量显著减少。LSD-t=33.003，P=0.000，差异具有统计学意义，提示了CD163分子具有增强肺癌细胞侵袭的能力。见图2。

图2　MH-2中CD163分子对细胞侵袭功能的影响Fig.2　Effect of CD163 on cell invasion in MH-2Note: *.P<0.001.

图3　MH-2中CD163分子对细胞增殖功能的影响Fig.3　Effect of CD163 on cell proliferation in MH-2Note: *.P<0.001.

2.5肺泡巨噬细胞中CD163对细胞增殖能力的影响各组CD163分子对肺癌细胞增殖能力的影响OD值分别为：PBS组：3.03±0.22，对照组(siRNA-NC)：2.87±0.25，肺泡巨噬细胞MH-2转染siRNA组(siRNA-FAM)：1.43±0.10。 经单因素方差分析，F=701.120，P=0.000；两两比较显示：肺泡巨噬细胞MH-S转染siRNA CD163后，同对照组相比，肺癌细胞A549增殖显著减少。LSD-t= 30.277，P=0.000，差异具有统计学意义，提示了CD163分子具有增强肺癌细胞增殖的能力。见图3。

3讨论

肺癌是目前为止世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。全世界每年新发肺癌病例数为180多万，占所有恶性肿瘤新发病例的13%，每年肺癌导致的死亡患者近160万，占所有恶性肿瘤死亡人数的19.4%[9]。在我国，肺癌的发病率和死亡率一直居于所有肿瘤的首位，据统计，2010年我国肺癌发病率占所有恶性肿瘤的19.59%，死亡率占所有恶性肿瘤的24.89%[10]，而且多数肺癌患者就诊时已经是晚期。巨噬细胞是一个异质性的群体，在不同的环境下表现为不同的功能。在肿瘤的发病过程中，肿瘤组织中有大量的巨噬细胞浸润，这种细胞被称之为肿瘤相关性巨噬细胞(Tumor associated macrophages，TAMs)[11]。但是对于TAM在肿瘤发病中的作用，尚存在不同观点。有学者研究发现，在胃癌、结肠癌等肿瘤中TAM高表达[12，13]，患者生存率高，预后好，TAM具有抑制肿瘤细胞的作用；而另外一些动物实验和临床研究指出甲状腺癌、肝癌、黑色素瘤等肿瘤中TAM高表达[14-16]，患者生存率低，死亡率高、预后差。CD163分子是富含半胱氨酸清道夫受体超家族一员，特异性地表达在单核巨噬细胞表面，经肿瘤坏死因子α转换酶(ADAM17)切割致其胞外段脱落，为可溶性CD163，进入患者血液循环系统；通过与肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(TWEAK)结合，参与肿瘤细胞的增殖或凋亡[17]。

本研究发现肺癌患者血浆中CD163分子的表达显著高于同期健康人群；此外，肺癌患者肿瘤组织中的CD163分子的表达显著高于相对应的癌旁组织，结果均提示CD163分子在肺癌患者血浆和肿瘤组织中表达水平的变化可能是调控肺癌细胞中的信号途径，参与肺癌的发生发展和转归关系密切。Tiainen等[18]研究研究发现乳腺癌患者体内M2样巨噬细胞浸润增加，高表达CD163分子，导致透明质酸的累积，与乳腺癌的发病和预后密切相关，这些结果从侧面支持了本研究。肿瘤细胞的侵袭和增殖能力与肿瘤的转移和生长速度密切相关，影响着肿瘤的发展和转归。本研究通过细胞转染技术，成功构建了CD163分子低表达的肺泡巨噬细胞MH-S细胞株，将肺巨噬细胞MH-S和肺癌细胞A549共培养，通过transwell实验发现，与正常表达CD163分子MH-S共培养的A549细胞的侵袭能力显著强于与低表达CD163分子MH-2共培养的A549细胞，说明CD163分子表达水平的高低影响着肺癌细胞的侵袭能力。此外，本研究运用CCK-8实验研究肺癌细胞增殖能力发现，与正常表达CD163分子MH-S共培养的A549细胞的增殖能力显著强于与低表达CD163分子MH-S共培养的A549细胞，说明CD163分子表达水平越高，肺癌细胞的增殖能力越强。CD163分子的表达水平影响肺癌细胞的侵袭和增殖能力。这与Yang等[19]的在肺癌患者恶性肿瘤胸腔积液中的研究结果是一致的。

综上所述，在肺癌患者血浆和肿瘤组织中CD163分子的表达水平显著升高，而且CD163分子可能增强肺癌细胞的侵袭和增殖能力，从而使肺癌生长速度加快，侵袭能力增强，这为肺癌诊断治疗和预测预后提供了理论参考依据。

参考文献：

[1] Meng J,Xie W,Cao L,etal.shRNA targeting HDGF suppressed cell growth and invasion of squamous cell lung cancer[J].Acta biochimica et biophysica Sinica,2010,42(1):52-57.

[2] Jemal A,Siegel R,Ward E,etal.Cancer statistics,2009[J].CA,59(4):225-249.

[3] Miller YE.Pathogenesis of lung cancer:100 year report[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2005,33(3):216-223.

[4] Qian BZ,Pollard JW.Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis[J].Cell,2010,141(1):39-51.

[5] Buddingh EP,Kuijjer ML,Duim RA,etal.Tumor-infiltrating macrophages are associated with metastasis suppression in high-grade osteosarcoma:a rationale for treatment with macrophage activating agents[J].Clin Cancer Res,2011,17(8):2110-2119.

[6] Omatsu M,Kunimura T,Mikogami T,etal.Difference in distribution profiles between CD163+tumor-associated macrophages and S100+dendritic cells in thymic epithelial tumors[J].Diagnostic Pathol,2014,9(1):215.

[7] Ma J,Liu L,Che G,etal.The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time[J].BMC Cancer,2010,10:112.

[8] Mansfield AS,Heikkila P,von Smitten K,etal.The presence of sinusoidal CD163(+) macrophages in lymph nodes is associated with favorable nodal status in patients with breast cancer[J].Virchows Archiv,2012,461(6):639-646.

[9] Genestreti G,Di Battista M,Cavallo G,etal.Maintenance therapy in non-small cell lung cancer[J].Expert Rev Anticancer Ther,2015:1-8.

[10]Chen W,Zheng R,Zhang S,etal.Annual report on status of cancer in China,2010[J].Chin J Cancer Res,2014,26(1):48-58.

[11]Thanee M,Loilome W,Techasen A,etal.Quantitative changes in tumor-associated M2 macrophages characterize cholangiocarci-noma and their association with metastasis[J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(7):3043-3050.

[12]Lin CN,Wang CJ,Chao YJ,etal.The significance of the co-existence of osteopontin and tumor-associated macrophages in gastric cancer progression[J].BMC Cancer,2015,15:128.

[13]Leimgruber A,Berger C,Cortez-Retamozo V,etal.Behavior of endogenous tumor-associated macrophages assessed in vivo using a functionalized nanoparticle[J].Neoplasia,2009,11(5):459-468,452 p following 468.

[14]Fang W,Ye L,Shen L,etal.Tumor-associated macrophages promote the metastatic potential of thyroid papillary cancer by releasing CXCL8[J].Carcinogenesis,2014,35(8):1780-1787.

[15]Ortega RA,Barham WJ,Kumar B,etal.Biocompatible mannosylated endosomal-escape nanoparticles enhance selective delivery of short nucleotide sequences to tumor associated macrophages[J].Nanoscale,2015,7(2):500-510.

[16]Wang T,Xiao M,Ge Y,etal.BRAF Inhibition Stimulates Melanoma-Associated Macrophages to Drive Tumor Growth[J].Clin Cancer Res,2015,21(7):1652-1664.

[17]Fabriek BO,van Bruggen R,Deng DM,etal.The macrophage scavenger receptor CD163 functions as an innate immune sensor for bacteria[J].Blood,2009,113(4):887-892.

[18]Tiainen S,Tumelius R,Rilla K,etal.High numbers of macrophages,especially M2-like (CD163-positive),correlate with hyaluronan accumulation and poor outcome in breast cancer[J].Histopathology,2015,66(6):873-883.

[19]Yang L,Wang F,Wang L,etal.CD163+tumor-associated macrophage is a prognostic biomarker and is associated with therapeutic effect on malignant pleural effusion of lung cancer patients[J].Oncotarget,2015,6(12):10592-10603.

[收稿2015-07-25]

(编辑张晓舟)

Expression of CD163 in patients of non-small cell lung and effects of cancer cell migration and proliferation

HUANGDong-Yun，XUWen-Jing，ZHOURui，XUXing-Xiang，ZHANGXu-Dong.

DepartmentofGerliatricMedicine,NorthernJiangsuPeople′sHospital,Yangzhou225001,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of CD163 in the plasma and tumor tissue of non-small cell lung cancer(NSCLC)patients,and the effects of cancer cell migration and proliferation.Methods: 35 cases of NSCLC patients in our hospital as the study group,and 35 healthy volunteers as control group,we used Real-time RCR to detect the expression of CD163 in the plasma and tumor tissue of NSCLC patients.Using small interfering RNA (siRNA) to inhibit the expression of CD163 in MH-2,and co-culture with A549.The level of cancer cell migration was observed by transwell and the level of cell proliferation was observed by CCK-8.Results: The expression of CD163 in the plasma and tumor tissue of NSCLC patients was significantly higher than the control group,the difference was statistically significant (P<0.05);after the expression of CD163 was suppressed in MH-2,the levels of cancer cell migration and proliferation were significantly decreased,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion: The expression of CD163 in the plasma and tumor tissue of NSCLC patients is increased,and may elevate the levels of cancer cell migration and proliferation.

[Key words]CD163;NSCLC;Migration;Proliferation

中图分类号R734.2

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)03-0410-05

作者简介：黄冬云(1980年-)，女，硕士，主治医师，主要从事肺癌诊断及治疗方面的研究。

通讯作者①。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.025