Noggin基因沉默表达载体的构建及效果评价
2016-04-14马雨楠游颖孙兆增曾林
马雨楠，游颖，孙兆增，曾林
(军事医学科学院实验动物中心，北京 100071)
研究报告
Noggin基因沉默表达载体的构建及效果评价
马雨楠，游颖，孙兆增*，曾林*
(军事医学科学院实验动物中心，北京100071)
【摘要】目的构建慢病毒介导的NogginRNAi干扰序列，并分析这些干扰序列对Noggin基因的沉默效果。方法针对目的基因Noggin的mRNA设计四条干扰序列，并将这些序列连接到Lenti-KD慢病毒载体，将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞，获得重组慢病毒。将重组病毒感染MC3T3-E1细胞，利用puromycin进行筛选，获得稳定表达细胞系。通过实时荧光定量PCR和Western blot技术分析不同干扰序列的干扰效果。结果实时荧光定量PCR结果显示，四种干扰序列对Noggin基因的表达都有一定的沉默效果，但只有shNoggin-1(P<0.01)对其表达影响显著。Western blot结果显示，四种干扰序列中只有shNoggin-1(P<0.01)对Noggin的表达蛋白具有显著的降低作用。结论获得了一种Noggin基因的干扰序列，该序列能够干扰Noggin基因mRNA的稳定性，从而影响蛋白的表达。该干扰序列可以用于部分敲除Noggin基因，从而用于研究Noggin基因的功能。
【关键词】Noggin基因；基因沉默；表达载体；Uncv无毛小鼠
Uncv无毛小鼠是由于常染色体基因突变导致其毛囊发育缺陷而产生的无毛性状。毛囊发育受多种基因、多条信号通路的协同调控，主要包括BMP、Wnt和Notch等信号通路。Uncv突变引起的小鼠毛囊发育缺陷是有助于研究毛囊发育调控的关键因素。而已有研究资料表明Noggin基因在毛囊的发育过程中发挥了重要作用[1]。
Noggin基因最初分离自非洲爪蟾的胚胎，将其mRNA注射至爪蟾胚胎，使其头部显著增大，由此命名(美国俚语中Noggin为“头，脑袋”的涵义)[2]。在体内Noggin基因对多个系统的发育和重塑的调控有着重要作用。Noggin与骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)高度结合，阻止其与相应受体的结合，直接拮抗BMP-2、-4、-7，从而抑制BMP作用的信号转导通路[3]。
本实验借助慢病毒介导的RNAi重组载体，对Noggin基因进行RNA干扰，筛选出有效的沉默表达载体，以便于研究Noggin基因对毛囊形态发育相关信号通路的影响。特别是研究Uncv无毛小鼠毛囊发育信号通路的调控，分析其在毛囊发育调控中的作用和机理。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂
EndoFree plasmid ezFlow mini kit(PD1220-02)、Gel extraction kit DC3511-01)、EZgeneTMtissue RNA kKit(R6311-01)为Biomiga品牌产品，DNA ligation kit(D6022)、PrimeScript RT reagent kit(RR047A)、SYBR® Premix Ex TaqTMII为Takara品牌产品，Puromycin(J593)为Amresco品牌产品，胎牛血清、DMEM高糖培养基、0.05%EDTA胰酶为HyClone品牌产品，lipofectamine 2000转染试剂、高糖DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s)培养基、DMSO为Invitrogen品牌产品，4×SDS上样缓冲液、1×PBS缓冲液、1 mol/L Tris-Cl、1.5 mol/L Tris-Cl为Solarbio品牌产品，抗Noggin兔多克隆抗体(ab16054)为Abcam品牌产品，HRP标记山羊抗兔二抗(CW0103)、HRP标记山羊抗小鼠二抗(CW0102)、抗β-actin鼠单克隆抗体(CW0096)、BCA蛋白定量试剂盒(CW0014)为康为世纪品牌产品，酵母粉、胰蛋白胨、NaCl等均为国产试剂。
1.1.2菌种及细胞株
Lenti-KD载体、pMD2.0G质粒、psPAX2质粒和HEK293T细胞由本实验室冻存，MC3T3-E1细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。实验于军事医学科学院实验动物中心屏障动物实验室进行【SYXK(军)2012-004】。
1.2实验方法
1.2.1慢病毒介导的Noggin基因RNAi重组载体的构建
(1)Noggin基因shRNA靶序列的设计
根据siRNA的设计原则，针对目的基因Noggin的序列，设计四条shRNA环形序列。利用网站(http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/life-science/rnai.html)设计出两条互补的小干涉RNA(small interfering RNA, siRNA)的模板序列，并以基因mRNA为模板设计合成二条RNAi特异性靶向序列。采用Blast软件对选择的靶序列进行同源分析，排除shRNA特异性抑制其他基因片段的情况。再在两条互补的碱基序列的5’端分别加入限制性内切酶BamHI、限制性内切酶EcoRI的酶切位点。设计的四条shRNA寡核苷酸序列见表1。
表1 shRNA寡核苷酸序列表
(2)shRNA载体的构建
设计的寡核苷酸单链由Invitrogen公司合成，经退火反应使其变为双链。用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切载体质粒Lenti-KD，将目的片段进行回收。用DNA ligation kit试剂盒连接酶切后的载体片段与退火后的双链DNA。连接产物转化DH5α感受态细胞，涂到氨苄青霉素平板上培养过夜，菌液PCR筛选出阳性克隆由华大公司进行测序。PCR引物见表2。
表2 引物序列表
(3)慢病毒包装
包装病毒前，种植293T细胞7×105/60 mm平皿，种植5个平皿，其中一个准备包装对照病毒shMock，其内所含序列不针对目的基因，没有敲低效果。shMock内所含序列为GATCCCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTTCCTGTCAGACGAGGGCGACTTA ACCTTAGGTTTTTG。用lipofectamine 2000转染试剂进行细胞转染，质粒pMD2.0G和psPAX2各1 μg分别加上质粒Lenti-KD shMock、shNoggin-1、shNoggin-2、shNoggin-3、shNoggin-4 1μg，进行病毒包装，培养3 d，收集上清。
(4)稳定细胞系建立
感染前，种植MC3T3-E1细胞2×105/孔于六孔板。过夜培养后，换含病毒液的培养基(1.5 mL培养基含polybrene 15 μg + 病毒液200 μL)，感染过夜。换新鲜培养基培养48～72 h，通过荧光显微镜，观察病毒感染情况。之后进行药物筛选，加入puromycin(10 μg/mL终浓度)。亲代细胞加入puruomycin的已经死亡，病毒感染的细胞，仍大部分存活，收获细胞，进行Western blot鉴定。
1.2.2Noggin基因沉默表达效果的鉴定
(1) 实时荧光定量PCR检测Noggin基因干涉效果
根据GenBank中β-actin基因和Noggin基因编码区序列，通过Primer Premier 5.0软件进行引物设计，和NCBI中Blast序列比对功能，初步检测引物的特异性。引物序列见表1.2。用EzgeneTMTissue RNA Kit试剂盒提取样本中总RNA，测定RNA浓度后，用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒进行反转录。按照SYBR® Premix Ex TaqTMII试剂说明书进行扩增。扩增程序为95℃ 60 s，(95℃ 15 s， 60℃ 15 s，72℃ 45 s)×40个循环，每组样本均设3次重复。由溶解曲线判定PCR反应的特异性，根据标准曲线以及荧光曲线的Ct值计算定量结果。使用SAS统计软件处理实验数据，得到四条干扰序列对目的基因mRNA的敲低效果。
(2) Western blot检测Noggin干扰效果
向收取的细胞沉淀中加入混好蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，充分吹打混匀，置于冰上裂解20 min，14 000 r/min 4℃离心10 min，吸取上清液。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，加适量4×SDS上样缓冲液，煮沸10 min。待配制好的12% SDS-PAGE凝胶干后，每孔加入等质量蛋白，最左侧加入彩色预染蛋白marker，恒压100 V电泳后，恒流250 mA转膜。封闭1 h(封闭液用5%脱脂奶粉)，按需要裁膜，目的蛋白膜加入1∶1000稀释的抗Noggin兔多克隆抗体，内参蛋白膜加入1∶5000稀释的抗β-actin鼠单克隆抗体，4℃孵育过夜。用TBST洗膜三次，每次8 min。分别加入对应的1∶8000稀释的二抗，室温孵育1.5 h。同样用TBST洗膜三次，每次8 min。将膜拼好后，逐滴加混合好的发光AB液，反应1 min后去除即可显影。
2结果
2.1PCR鉴定构建的shRNA载体
注：M：1kb ladder marker；1：Lenti-KD质粒；2：BamHI、EcoRI双酶切后的质粒。图1 Lenti-KD载体双酶切鉴定Note. M: 1kb ladder marker; 1: Lenti-KD plasmid; 2: The product of plasmid Lenti-KD digestion with BamHI and EcoRI.Fig. 1 Enzyme digestion analysis of the plasmid Lenti-KD
用限制性内切酶BamHI和EcoRI对载体质粒Lenti-KD进行双酶切鉴定，得到目的片段(图1)。目的片段大小在6000～8000 bp，与预期结果7853 bp基本符合。酶切前由于质粒的超螺旋，会看到两条带，经过酶切质粒被线性化，而酶切切下的片段很小，电泳看不到。将shRNA克隆入EcoRI和BamHI双酶切产生的切口。
用DNA Ligation Kit试剂盒连接酶切后回收的载体片段与退火后的双链DNA，将连接产物转化到DH5α感受态细胞，用菌液PCR方法筛选出阳性克隆(图2)，阳性克隆得到170 bp的PCR产物，阴性克隆得到105 bp的产物，或者因为重组没有产物。筛选出的阳性克隆送华大公司测序进行进一步的验证，测序结果正确。
注：A：正常MC3T3-E1细胞；B：阴性对照病毒shMock感染MC3T3-E1细胞；C-F：病毒shNoggin-1、shNoggin-2、shNoggin-3、shNoggin-4感染MC3T3-E1细胞。图3 慢病毒感染MC3T3-E1细胞荧光观察(×100)Note. A: MC3T3-E1 Cells; B: MC3T3-E1cells with negative virus infection; C-F: MC3T3-E1cells infected with different viruses ( c: shNoggin-1; d: shNoggin-2; e: shNoggin-3; f: shNoggin-4).Fig.3 Fluorescence observation of the MC3T3-E1 cells infected with Lenti virus(×100)
注：M：700 DNA marker；1，2：重组质粒阳性克隆。图2 重组质粒PCR鉴定结果Note. M: 700 DNA marker；1, 2: The PCR product of recombinant plasmid.Fig.2 The PCR products of recombinant plasmid
2.2包装的慢病毒感染MC3T3-E1细胞荧光观察
用293T细胞包装的慢病毒感染MC3T3-E1细胞，感染过夜，换新鲜培养基培养48～72 h后，通过荧光显微镜，观察病毒感染情况(图3)。可以明显观察到荧光，表明感染成功。之后进行药物筛选，得到稳定细胞系。
2.3实时荧光定量PCR检测Noggin基因干涉效果
通过IQ5荧光定量PCR仪自带软件的数据以β-actin为内参，用2-△△Ct的方法处理数据和GraphPAd Prism 5软件作图，结合SAS 9.2分析软件得到以下数据(图4)，表明shNoggin-1(P<0.01)差异有显著性、shNoggin-2(0.01
2.4Western Blot检测Noggin干扰效果
RNAi在哺乳动物的细胞中是由于靶基因mRNA水平的降低引起靶蛋白表达水平的降低。为了确定干涉后蛋白表达变化是否与mRNA表达相似，选择Noggin多克隆抗体，用Western blot的方法分析蛋白表达水平的变化(图5 A)，并通过Photoshop 7.0灰度分析软件，结合SAS 9.2分析软件得到以下数据(图5 B)。Western blot结果显示，设计的4条干扰序列中，shNoggin-1(P<0.01)差异有显著性、shNoggin-2和shNoggin-4(P>0.05)差异无显著性、shNoggin-3(P<0.01)虽差异极显著但并非表达量下降，其中shNoggin-1干扰序列的干扰效率最高，与实时定量PCR的结果相似。
注：a：shMock阴性对照；b-e：干扰序列shNoggin-1、shNoggin-2、shNoggin-3、shNoggin-4；** P<0.01与shMock阴性对照组相比差异有显著性，*P<0.05与shMock阴性对照组相比差异有显著性。图4 实时荧光定量PCR检测Noggin基因干扰效果Note. a: Negative sequence; b-e: Different Interference sequences( b: shNoggin-1; c: shNoggin-2; d: shNoggin-3; e: shNoggin-4); **P<0.01 means extremely significant difference compared with the negative control, *P<0.05 means significant difference compared with the negative control.Fig.4 Identification of Noggin gene interference effect using RT-PCR
注：A：1：shMock阴性对照；2-5：干扰序列shNoggin-1、shNoggin-2、shNoggin-3、shNoggin-4；B：a：shMock阴性对照；b-e：干扰序列shNoggin-1、shNoggin-2、shNoggin-3、shNoggin-4；** P<0.01与shMock阴性对照组相比差异有显著性。图5 Western Blot检测Noggin干扰效果Note.A: 1: Negative sequence; 2-5: Different Interference sequences(2: shNoggin-1; 3: shNoggin-2; 4: shNoggin-3; 5: shNoggin-4). B: a: Negative sequence; b-e: Different Interference sequences( b: shNoggin-1; c: shNoggin-2; d: shNoggin-3; e: shNoggin-4); **P<0.01 means extremely significant difference compared with negative control.Fig.5 Identification of Noggin interference effect using Western blot
3讨论
在体内Noggin基因对多个系统的发育和重塑的调控有着重要作用。Noggin与BMP高度结合，阻止其与相应受体的结合，从而抑制BMP作用的信号转导通路，BMP主要是通过经典的Smad路径传导信息，发挥其生物学作用[4]。BMP家族成员参与毛囊发育的各个环节，主要起抑制作用。Noggin基因在BMP信号通路中通过抑制BMP信号，促进毛囊的发育；Noggin-Shh信号能调节毛发的形态，能促进诱导毛囊的生长[1]。BMP信号通过调节细胞周期循环调节胚胎和神经组织发育[5]；其抑制剂Noggin在神经系统发育及分化中也有重要作用，能促使脑及神经组织的发育，且在背侧中胚层缺失时直接诱发出神经组织，因而Noggin被认为是较有前途的内源神经信号[6]。Noggin是骨骼系统发育所必需的重要调控基因，人们研究发现正常的关节、韧带、软骨形成需要正确而适当的Noggin及BMPs/CDMP表达[7,8]。此外已有的研究显示，以BMP抑制剂Noggin干预MC3T3-E1细胞，并加机械离心力刺激后，抑制了Runx2的表达，阻断BMP信号通路[9]，提示MC3T3-E1细胞与BMP信号通路密切相关。为了便于敲低Noggin后对BMP信号通路的研究，我们选用MC3T3-E1细胞获得能有效抑制Noggin基因表达的稳定细胞系。
RNA干扰是最初由Andrew发现线虫体内mRNA由特异的双链RNA介导产生降解，基因表达受其正义RNA抑制的现象[10]。Tuchl[11]发现RNA干涉能够特异性高效沉默哺乳动物细胞内靶基因。RNAi是Dicer酶在胞质中剪切长双链RNA生成21-25nt的双螺旋分子siRNA，其双螺旋结构能被参与RNA干扰的分子特异识别，其中一条单链能与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)结合形成蛋白复合物，该复合体可切断与siRNA互补的mRNA分子或靶基因翻译的过程，进而抑制相应基因在细胞内的表达[12]。因此，RNAi近些年多用于未知基因生物学功能的研究，迅速成为发展前景广阔且实用的生物技术。本实验利用RNA干扰技术对Noggin基因进行RNA干扰，从而研究Noggin基因对毛囊干细胞形态、分化和对相关信号通路的影响，分析其在毛囊发育调控中的作用和机理。
慢病毒载体是一种复制缺陷性逆转录病毒载体，具有可插入细胞基因组、稳定表达、持续时间长、对细胞活性要求低、包装周期短等优点，因此成为携带干扰RNA的理想载体[13]，使RNAi干扰作用持久性表达。siRNA技术是利用具有同源性的双链RNA诱导沉默序列特异的目的基因，并迅速阻断该基因的活性，从而观察该基因对细胞的影响。近年来，有关慢病毒载体介导RNAi的相关研究[14]逐渐展现在研究内源性基因功能和基因治疗中该技术的重要作用。本实验所采用的慢病毒载体Lenti-KD，以其自身RNA为模板在宿主细胞内反转录合成cDNA，再以后者为模板合成双链DNA，环化，整合在宿主细胞的染色体内，进而能够得到长期的表达。
本研究成功构建了小鼠Noggin基因慢病毒介导的RNAi载体，并转染小鼠MC3T3-E1成骨细胞，得到有效抑制Noggin基因表达的稳定细胞株，为后续研究Noggin基因对毛囊形态发育的相关信号通路的影响，分析其在毛囊发育和调控中的作用和机理提供依据。结果发现，shNoggin-1干扰效率最高，其明显下调了MC3T3-E1细胞中NogginmRNA和蛋白的表达，与对照组之间差异有显著性(P<0.01)。干扰载体构建成功，为进一步检测敲低Noggin基因对相关信号通路的影响提供基础。
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Construction and evaluation of gene silencing vectors ofNoggin
MA Yu-nan, YOU Ying, SUN Zhao-zeng*, ZENG Lin*
( Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China)
【Abstract】ObjectiveTo construct the retroviral-mediated short hairpin RNA(shRNA) expression vectors of Noggin, and to analyze the silencing effect of the shRNA. MethodsFour interference sequences were designed based onNoggin mRNA, and connected to Lenti-KD vectors. The recombinant plasmids were transiently transfected into HEK-293T cells, and finally obtained the recombinant virus.Then MC3T3-E1 cells were infected with the recombinant virus and screened by puromycin.The gene silencing effect of shRNA was evaluated using RT-PCR and Western blot. ResultsRT-PCR results showed that all the four interference sequences had silencing effect on the expression of Noggin, but only shNoggin-1(P<0.01) was different significantly. Western blot results showed that among the four interference sequences, only shNoggin-1(P<0.01) showed a significantly lowering effect on the expression of Noggin. ConclusionsOne interference sequence of Noggin gene is obtained, which can interfere the stability of mRNA of the Noggin gene, by affecting the protein expression. It is useful for the further study of unknown biological function of Noggin.
【Key words】Noggin; Gene silencing; Expression vector; Uncv hairless mice
[收稿日期]2015-07-14
Corresponding author:ZENG Lin, E-mail: zenglin1965@126.com. SUN Zhao-zeng, Email: laxszz@aliyun.com
Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2016.01.007
【中图分类号】Q95-33
【文献标识码】A
【文章编号】1005-4847(2016) 01-0037-06
[作者简介]马雨楠(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：实验动物学。E-mail: mynrr324@126.com。[通讯作者]曾林(1965-)，男，研究员，研究方向：实验动物科学，E-mail: zenglin1965@126.com；孙兆增(1977-)，男，副研究员，研究方向：实验动物分子遗传学，Email: laxszz@aliyun.com。
[基金项目]国家自然科学基金重点项目(31030058)，国家科技支撑计划(2011BA115B03)。
