张迹纪俊宾 于晗 李智

（淮阴师范学院生命科学学院/江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室 江苏淮安 223300）

多菌灵微生物降解研究进展

张迹*纪俊宾 于晗 李智

（淮阴师范学院生命科学学院/江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室 江苏淮安 223300）

多菌灵是一种高效广谱的内吸性杀菌剂，广泛应用于作物的病害防治和工业杀菌。其化学性质稳定，在环境中残留期较长，对环境和人类的健康均构成严重威胁。本文从微生物菌株资源、代谢途径及关键酶和基因等几个方面综述了国内外对多菌灵微生物降解的最新研究进展。为多菌灵污染环境的微生物修复提供参考。

多菌灵 降解途径 生物修复

农药在现代农业生产过程中发挥了重要的作用,但农药的大量生产和使用也造成了严重的环境污染。多菌灵又名棉萎灵、苯并咪唑44号,是一种广谱、内吸性杀菌剂,对多种由真菌（如半知菌、多子囊菌）引起的作物病害有防治效果。多菌灵目前已成为我国产量最大的内吸杀菌剂品种［1］,广泛应用于果树、蔬菜等多种农作物真菌病害的防治［2］。多菌灵的化学性质稳定,在环境中残留期较长,属于持久性污染物［3］。由多菌灵引起的环境污染和危害正日益受到关注,据研究,高浓度的多菌灵对植物体内的多种酶存在影响,对哺乳动物也存在一定的毒害作用,可损伤某些动物的生殖系统导致不孕不育,可引起动物的内分泌紊乱和哺乳动物肝病、存在潜在的致癌、致畸、致突变的“三致”作用,导致染色体畸变而影响后代繁衍等［4-6］。在美国和欧盟国家是禁用农药,在我国和其他一些国家则允许使用［1］。2002年被我国列为环境激素类化学农药［7］。

微生物修复是经济可行的污染环境修复技术,具有成本低廉,无二次污染等优点,是具有较好发展前景的污染环境修复技术［8-10］。关于多菌灵微生物降解和污染环境生物修复的研究报道越来越多,相关研究成为近年来国内外环境微生物领域的研究热点之一。然而到目前为止,笔者尚未见有关多菌灵微生物降解相关的综述报道。为让读者方便了解目前国内外多菌灵微生物降解研究现状,并对多菌灵微生物降解和污染环境生物修复研究提供借鉴,本文将从微生物菌株资源、代谢途径及关键酶和基因等几个方面综述国内外对多菌灵微生物降解的最新研究进展。

1 降解多菌灵的微生物

环境中多菌灵主要通过生物降解［6］。分离筛选多菌灵高效降解菌株是研究多菌灵降解及其污染环境生物修复的关键所在。目前国内外已报道多个属的菌株可以高效降解多菌灵,这些菌株分别属于红球菌属［2,11-14］、诺卡氏菌属［15］、假单孢菌属［16］、芽孢杆菌属［17］和罗尔斯通氏菌属［18,19］。然而,在数量上仍以红球菌属等革兰氏染色阳性菌株为主。

许敬亮等分离了一株红球菌属（Rhodococcus sp.）菌株djl-6［11］,该菌株对M9培养基中得多菌灵具有较高的降解效率,降解率可达到55.56mg·L-1·d-1。Holtman M.A.和Kobayashi D.Y.分离纯化了6株能够降解多菌灵的菌株［12］,经鉴定,这些菌株均为红球菌属（Rhodococcus sp.）菌株,且其中5株为Rhodococcus erythropolis。王志春等研究报道了多菌灵高效降解菌株Rhodococcus jialingiae djl-6-2［13］,该菌株能多菌灵为唯一碳氮源生长,并能高效地降解液体培养基和土壤中的多菌灵,硝酸铵的添加能够明显抑制菌株对多菌灵的降解。Pandey G.等从多菌灵污染土壤中分离了一株诺卡氏菌属Nocardioides sp.高效多菌灵降解菌株SG-4G［15］,该菌株能够通过2-氨基苯并咪唑和2-羟基苯并咪唑等中间代谢产物矿化多菌灵。Fang Hua 等从土壤中分离纯化了一株能以多菌灵为唯一碳源和能源生长的假单孢菌Pseudomonas sp.CBW［16］。张丽珍等分离筛选了一株能高效降解多菌灵的芽孢杆菌菌株NY97-1［17］,该菌株被鉴定为短小芽孢杆菌Bacillus Pumilus。张桂山等报道了一株革兰氏阴性细菌Ralstonia sp.1-1［18,19］,该菌株能够以多菌灵为唯一碳源和能源生长,并能在含有酵母膏时高效地降解多菌灵。

2 微生物降解多菌灵的代谢途径

目前为止,还没有较完整的代谢途径被阐述清楚,在已报道的多菌灵降解菌株中,研究者检测到了一些代谢产物,并推测了部分代谢途径。其中菌株Rhodococcus erythropolis djl-11［14］、Nocardioides sp.Strain SG-4G［15］、Pseudomonas sp. CBW［16］在降解多菌灵的过程中均检测到了2-氨基苯并咪唑和2-羟基苯并咪唑两种中间代谢产物；菌株Rhodococcus jialingiae djl-6-2［13］降解过程中除了检测到上述两种中间代谢产物外,还检测到了苯并咪唑；菌株Rhodococcus sp. djl-6［11］降解多菌灵的过程中检测到了2-氨基苯并咪唑和苯并咪唑。

基于上述检测到的几种中间代谢产物和推测的各菌株降解多菌灵的部分代谢途径,可将目前知道的微生物降解多菌灵的途径大致归纳为3条途径：首先各菌株均先将多菌灵转化成2-氨基苯并咪唑,之后的途径便有所差异。1.菌株SG-4G、djl-11、CBW等将2-氨基苯并咪唑转化成2-羟基苯并咪唑,进而再通过一些未知的途径进一步彻底降解多菌灵；2.菌株djl-6将2-氨基苯并咪唑脱氨基,转化成苯并咪唑,再经未知途径彻底降解多菌灵；3.菌株djl-6-2将2-氨基苯并咪唑转化生成2-羟基苯并咪唑或直接脱氨基生成苯并咪唑,苯并咪唑也将转变成2-羟基苯并咪唑然后再转化为邻苯二酚结构,并通过邻苯二酚开环途径将多菌灵中的苯环结构开环并降解。

3 多菌灵微生物降解过程中的关键酶和基因

从酶以及基因水平上阐明菌株降解多菌灵的分子机理可为菌株进行稳定性遗传改造及环境修复提供参考。目前国内外有关多菌灵降解基因-酶的报道极少。Pandey等［15］通过酶蛋白纯化和N末端测序等技术手段从多菌灵降解菌株Nocardioides sp.SG-4G中首次克隆到了多菌灵水解酶基因mheI,该基因编码的多菌灵水解酶MheI含有242个氨基酸残基,负责催化多菌灵降解第一步反应,即将多菌灵水解成2-氨基苯并咪唑。基因mheI经密码子优化后在大肠杆菌中异源表达,并纯化了含6*His标签的多菌灵水解酶MheI,生物化学特性研究表明该酶水解多菌灵的Km和Kcat值分别为6.1μM和170/min。此外,zhang等［14］从菌株djl-11的基因组DNA上克隆了一个疑似多菌灵水解酯酶基因,该基因与上述克隆自菌株SG-4G中的多菌灵水解酶基因mheI具有高达99%的同源性。

4 多菌灵污染环境微生物修复研究

研究者们对多菌灵在环境中的危害及其去向开展了广泛的研究,分离了一些多菌灵降解菌株,并对其降解特性和机理开展了较全面的研究和探索。在多菌灵污染环境微生物修复方面也开展了积极的研究和尝试。

王志春等［13］研究了菌株djl-6-2降解土壤中多菌灵的特性,其研究结果显示：经过20天的降解,灭菌土壤中的多菌灵降解率只有约5%；未灭菌土壤中的多菌灵降解率约为15%；不论是灭菌土壤还是未灭菌的土壤,在添加了菌株djl-6-2之后,样品中的大部分多菌灵被降解,降解率超过90%,而二者之间没有显著区别。该研究结果表明：1.多菌灵在土壤中比较稳定；2.土著微生物对多菌灵只有较低的降解率；3.菌株djl-6-2具有对多菌灵污染土壤生物修复的能力,且不会受到土著微生物的影响。

Pandey等［15］将菌株SG-4G灭活后对其降解污染水体中多菌灵的特性开展了一些研究。结果表明,1.菌株SG-4G经发酵和放射杀菌并冷冻干燥后,能有效地降解MM中的多菌灵和2-氨基苯并咪唑；2.24小时内能有效地去除自来水中的高浓度多菌灵（500mg/L）；3.在添加剂量为0.05-1g/L时,该灭活菌株能够在16小时以内有效去除农业废水中初始浓度为207mg/L的多菌灵。

5 存在问题和展望

在许多国家和地区,多菌灵仍被大量生产和广泛应用,其对环境造成的污染和危害仍在继续。用于其污染环境微生物修复的菌株资源仍有一定的局限性,目前虽有不少多菌灵降解菌株的报道,但大多是红球菌属等革兰氏阳性细菌,且许多菌株独立降解多菌灵的效率不高,需要借助外源有机碳氮源才能实现高效降解。现有的多菌灵降解菌株资源依然有限,远不能满足相关研究及污染环境修复的需求,需要进一步丰富高效多菌灵降解菌株资源库。

微生物降解多菌灵在代谢途径和基因水平上的机理还远没有阐明,对多菌灵污染环境微生物修复的指导意义有限。目前研究者只检测到少数几个中间代谢产物,推测了部分代谢途径。

mheI-MheI是目前报道的唯一明确功能的多菌灵降解关键基因-酶系统,而且也只负责催化多菌灵降解的第一步水解反应,有关多菌灵微生物降解在基因水平上的分子机理还远没有阐述清楚,因此还有必要对微生物降解多菌灵的基因进行全面深入的研究。此外,由于不同菌株降解多菌灵的代谢途径不尽相同,故而不同的微生物菌株中编码多菌灵降解酶系的基因也应具有多样性,需要广大研究者进一步深入研究。

笔者认为,在未来相当长的时间内,多菌灵的污染和危害还将持续存在。环境微生物研究者还需要通过不懈的努力,分离获得更多更稳定高效的多菌灵降解菌株,并清晰地阐明微生物降解多菌灵的代谢途径及相关的酶和基因。亦可在此基础之上,通过基因工程的手段构建更加稳定高效的多菌灵降解基因工程菌。最终将这些菌株应用于多菌灵污染环境的微生物修复中,有效地解决多菌灵对环境的污染等问题。

［1］巍中华，徐娟，郭明霞，等.国内多菌灵的研究进展［J］.安徽农业科学，2015，43（3）：125-141.

［3］International programme on chemical safety.Environmental health criteria 149：carbendazim ［EB/OL］.http：//www.inchem.org/ documents/ehc/ehc/ehc149.htm，2005-09-10.

［4］Pan S.R.，Shao H.S.，Jing X.A.，et a1.，The fate of ［2-14C］carbendazim in rats［J］.Nuclear Techniques，1989，12（6）： 376-379.

［5］Sarrif A.M.，Arce G.T.，Krahn D.F.，et a1.，Evaluation of carbendazim for Gene mutations in the Salmonella/Ames plateincorporation assay：the Role of aminophenazine impurities［J］. Mutat.Res.，1994，32（6）：43-56.

［6］Pattanasupong A.，Nagase H.，Inoue M.，et a1.，Ability of a microbial consortium to remove pesticide，carbendazim and 2，4-dichlorophenoxyacetic acid［J］.World J.Microbiol. Biotechnol.，2004，20（5）：517-522.

［7］马承铸，顾真荣.环境激素类化学农药污染及其监控［J］. 上海农业学报，2003，19（4）：98-103.

［8］滕应，骆永明，李振高.污染土壤的微生物修复原理与技术进展［J］.土壤，2007，39（4）：497-502.

［9］陶雪琴，党志，卢桂宁，等.污染土壤中多环芳烃的微生物降解及其机理研究进展［J］.矿物岩石地球化学通报，2003，22（4）：356-360.

［10］温小乐，杨燕娜.有机污染土壤的生物修复实践及其发展前景［J］. 环境科学与技术，2008，7（31）：62-67.

［11］Xu J.L.，Gu X.Y.，Shen B.，et a1.，Isolation and characterization of a carbendazim-degrading Rhodococcus sp. djl-6［J］. Curr.Microbiol.，2006，53，72-76.

［12］Holtnan M.A.，Kobayashi D.Y..Identification of Rhodococcus erythropolis isolates capable of degrading the fungicide carbendazim［J］.Appl.Miccrobiol.Biotechnol.，1997， 47：578-582.

［13］Wang Z.C.，Wang Y.Y.，Gong F.F.，et al.，Biodegradation of carbendazim by a novel actinobacterium Rhodococcus jialingiae djl-6-2［J］.Chemosphere，2010，81：639--644.

［14］Zhang X.，Huang Y.，Harvey P.R.，et al.，Isolation and Characterization of Carbendazim degrading Rhodococcus erythropolis djl-11［J］.Plos one，2013，8（10）：e74810.

［15］Pandey G.，Dorrian S.J.，Russell R.J.，et a1.， Cloning and biochemical characterization of a Novel Carbendazim （Methyl-1-H-Benzimidazol-2-ylearbamate）-Hydrolyzing esterase from the newly isolated Nocardioides sp. strain SG-4G and its potential for use in enzymatic bioremediation［J］. Appl. Environ. Microbiol.，2010，76（9）：2940-2945.

［16］Fang H.，Wang Y.Q.，et al.，Isolation and characterization of Pseudomonas sp.CBW capable of degrading carbendazim［J］. Biodegradation，2010，21：939-946.

［17］张丽珍，乔雄梧，马利平，等.多菌灵降解菌NY97-1的鉴定及降解条件［J］.环境科学学报，2006，26（9）：1440-1444.

［18］张桂山，贾小明，马晓航，等.一株多菌灵降解细菌的分离、鉴定及系统发育分析［J］.微生物学报，2004，44（4）：417-421.

［19］Zhang G.S.，Jia X.M.，Cheng T.F.，et al.，Isolation and characterization of a new carbendazim degrading Ralstonia sp.Strain［J］.World J.Microbiol. Biotechnol.，2005，21：265-269.

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A

1674-2060（2016）03-0013-02

国家自然科学基金青年基金项目 （编号：31300099）；江苏省高等学校大学生创新训练计划（ 编号：201310323046X）。

张迹，博士，讲师，研究方向：环境污染物微生物降解及污染环境微生物修复。