王有娣，杨圆圆，李佳虹，高思远，杨晨，臧林泉

(广东药学院　1.中药学院； 2.药科学院，广东 广州 510006)



天然药物化学

基于受体配体-HPLC-MS联用技术筛选五味子镇静催眠成分方法学的研究

王有娣1，杨圆圆2，李佳虹1，高思远2，杨晨1，臧林泉2

(广东药学院1.中药学院； 2.药科学院，广东 广州 510006)

摘要:目的 建立基于受体配体结合竞争试验和HPLC-MS分析技术联用初步确认五味子镇静催眠成分的方法学，为快速高效地分析五味子镇静催眠活性有效成分并确认作用靶标奠定方法学基础，也为简便迅速地研究中药中有效物质基础和作用机理提供新的研究思路和方法。方法 运用受体配体结合原理，先制备大鼠脑组织中包含GABA(γ-氨基丁酸)受体的蛋白质提取物，构建供药物与GABA受体结合的体外模型，采用已知具有通过结合GABA受体发挥镇静催眠作用的地西泮，与五味子竞争性结合同一受体成分GABA的方法，用地西泮竞争置换出结合GABA受体的五味子中单体成分，通过HPLC-MS分析表征，鉴定结合GABA受体的五味子成分，再通过检索文献确认该成分是否具有镇静催眠活性的作用。结果 利用受体配体结合技术和HPLC-MS联用技术成功建立了快速筛选单味中药中结合已知药靶成分的方法。利用该方法研究五味子中镇静催眠活性有效成分，通过模型药地西泮与五味子提取液竞争结合脑组织中的GABA受体，结合HPLC-MS检测分析结果，初步筛选出五味子中结合GABA受体的成分可能为五味子甲素(分子式：C24H32O6，相对分子质量：416.51)，对比文献结果提示五味子甲素为五味子产生镇静催眠作用的有效成分。结论 初步建立了基于受体配体结合-HPLC-MS联用技术筛选单味/复方中药中有效成分的方法学，同时利用该方法初步分析出了五味子中结合GABA受体的成分为五味子甲素。

关键词:受体配体结合； HPLC-MS； 五味子； 有效成分； 方法学

中药成分复杂，作用机制不明确，提取工艺繁琐等问题限制了中药的发展[1]，快速筛选和发现中药有效物质是创制现代中药的源头工作，同时也是中药现代化研究的重要任务。筛选和发现中药有效物质有助于研发创新中药、诠释中医药理论科学内涵、提升中成药质量标准以及中药制药技术升级换代，为中药二次开发提供依据[2]，同时也是创新药物研究的重要源泉[3]。如何从宏观的中医理论进入分子水平阶段，从分子水平去考察和解释中药的作用机制[4]，是中医中药的重要突破口。

五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.或华中五味子SchisandrasphenantheraRehd. et Wils.的干燥成熟果实[5]。前者习惯称为“北五味子”，后者习惯称为“南五味子”。“北五味子”目前主要用于治疗神经衰弱、失眠等症[6]。对五味子木脂素类成分研究发现，不同产地五味子药材中均含有五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲等6种木脂素类成分，且均以五味子醇甲的质量分数最高，五味子丙素质量分数最低[7]。

受体理论是药效学的基本理论之一，是从分子水平解释生命的生理和病理过程、药物的药理作用机制、药物分子的结构效应关系的一个重要依据[8-9]。受体配体结合具有立体选择性、饱和性、可逆性和高亲和力的特点[10]。本研究聚焦于中药有效物质发现技术领域，着重研究基于化学生物学原理的中药有效物质快速发现新方法，创新提出并研究建立基于受体竞争性技术筛选五味子镇静催眠活性成分的方法学，采用已知通过结合GABA(γ-氨基丁酸)受体发挥镇静催眠作用的地西泮，与五味子竞争性结合同一受体成分GABA的方法，将五味子中与GABA受体结合的单体化合物竞争置换出来，通过HPLC-MS分析表征，鉴定出结合GABA受体的五味子中单体有效成分，再通过检索文献确认该成分是否具有镇静催眠的活性作用。

1仪器与材料

1.1仪器

FW177-中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；DT系列电子天平(常熟长青仪器仪表厂)；SY-5000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；AUY120电子分析天平(日本岛津公司)；DELTA 320 pH计[梅特勒-托利多(上海)分公司]；IKA-T10组织分散机(德国IKA公司)；Thermo240高速离心机(Thermo electron corporation)；THZ-82水浴恒温振荡器(江苏金坛市宏华仪器厂)；KQ-100M超声波清洗器(东莞市科桥超声波设备有限公司)；TSQ Quantum Ult ra液质联用色谱仪(美国ThermoFisher公司)；AQUITY UPLC BEH C18色谱柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm，美国Waters公司)；SK8200LHC超声波清洗器(上海科导超声仪器公司)。

1.2药材与试剂

五味子购于广州市清平中药材市场，经广东药学院药科学院王定勇老师鉴定为五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.。五味子提取液制备：中药粉碎机粉碎，精密称取50 g，按药量的8～12倍加蒸馏水浸泡2 h润湿，加热煮沸2 h后，16层纱布滤过，取残渣继续加0.5倍水煮沸1.5 h，滤过，合并2次煎液，置旋转蒸发仪浓缩至生药质量浓度为5 g/mL，于4 ℃保存备用。

地西泮注射液(天津药业焦作有限公司)，试验时用PBS缓冲液稀释为所需浓度；BCA蛋白质定量试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；水为屈臣氏蒸馏水。

1.3动物

SPF级雄性Wistar大鼠3只，体质量200～250 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(粤)2013-0034。

2方法与结果

2.1牛血清白蛋白标准曲线的制备

用与待测样品相同的稀释液(三蒸水)根据表1中梯度稀释方法将牛血清蛋白(BSA)标准品稀释到所需要的各个不同浓度，并将稀释好的各个浓度的BSA标准品分别装在洁净1 mL安瓿瓶中，每个1 mL安瓿的BSA标准品足够用于制备下述所列出的任意一组稀释范围的标准品，并且每个稀释浓度的标准品的体积足够用于3次重复检测。

表1　各个质量浓度的BSA标准品制备方案

注：表格中B瓶样品、C瓶样品、E瓶样品、F瓶样品、G瓶样品分别为配制得到的B、C、E、F、G安瓿瓶中的BSA标准品。

检测各浓度BSA标准品吸光度值：取各个稀释浓度的BSA标准品各25 μL，加入到微孔板中(检测范围为25～2 000 μg/mL)。在每一个孔中加入BCA工作液(A液∶B液体积比为50∶1)200 μL，并在振荡器上振荡30 s，使充分混合。将微孔板密封，在37 ℃孵育30 min，将微孔板冷却至室温，使用微孔板读数仪，测量样品在570 nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程y=0.001 1x-0.071 9(r=0.998 4)，表明质量浓度在25～2 000 μg/mL范围内与吸光度线性良好。

2.2脑组织蛋白受体制备[11]

取大鼠3只，处死，迅速取脑组织，置于预先冷冻的PBS液漂洗2次，用滤纸吸干，称定质量并记录(操作要迅速)，将组织剪碎，放入50 mL离心管中，按匀浆液体积等于组织质量的9倍的量加足PBS液，在冰浴中匀浆6次(15 s/次)，约2 min；匀浆液分装在15 mL普通离心管，以3 500 r/min、4 ℃离心20 min，弃去沉淀，保留上清液，12 000 r/min、4 ℃离心30 min，取沉淀，弃去上清液，悬浮于5 mL PBS缓冲液中，取少量混悬液按“2.1”项下方法进行蛋白浓度的测定，其余存放于-20 ℃备用，以上整个操作过程应保持在低温下进行。

2.3药物分子体外竞争性结合受体试验[12]

试验样品共分为3组，分别为五味子组、地西泮组及五味子+地西泮组。

五味子组：组成成分为1 mL蛋白+1 mL五味子提取液(质量浓度为5 mg/mL) +3 mL PBS液。处理方法：蛋白1 mL和五味子提取液1 mL，补充PBS至5 mL，充分混匀，将试管置37 ℃孵育1 h，用玻璃纤维微孔滤膜滤过，取下滤膜(滤膜中截留了与蛋白结合的成分)，将滤膜剪碎置于离心管中，加入体积分数50%甲醇5 mL，超声助溶10 min，2 500 r/min高速离心15 min，取上清液，得到竞争后样品，用0.22 μm一次性有机小滤膜滤过，即得。

地西泮组：组成成分为1 mL蛋白+2 mL地西泮溶液(质量浓度为5 mg/mL) +2 mL PBS液。处理方法：蛋白1 mL和地西泮溶液2 mL，补充PBS至5 mL，充分混匀。后续处理与五味子组相同。

五味子+地西泮组：组成成分为1 mL蛋白+1 mL五味子提取液(质量浓度为5 mg/mL) +2 mL地西泮(质量浓度为5 mg/mL) +1 mL PBS液。处理方法：蛋白1 mL和五味子提取液1 mL，充分混匀，分别将试管置37 ℃孵育1 h，加入地西泮溶液2 mL，补充PBS至5 mL，充分混匀。后续处理与五味子组相同。

2.4HPLC-MS法对五味子提取液镇静催眠有效成分的表征

液相色谱条件：AQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；进样量为10 μL；流速为0.8 mL/min；以水为流动相A，乙腈为流动相B，如表2进行梯度洗脱。

表2　梯度洗脱程序

质谱参数：ESI+，分子质量扫描范围(m/z)：100～1 500。

在上述条件下，将以上3组样品进行HPLC-MS测定，总离子流色谱图见图1。可见，原本出现于五味子组的保留时间为6.83 min的色谱峰，在五味子+地西泮组的色谱图中消失了。进一步对保留时间为6.83 min处的色谱峰进行质谱分析，得该物质的m/z为415，见图2。为推断该物质是否是五味子中的镇静催眠有效成分，对五味子的各成分情况进行文献调研，结果显示该物质的m/z值与五味子中的联苯环辛烯类木脂素物质五味子甲素(deoxyschizandrin，分子式为C24H32O6，相对分子质量为416.51)吻合，而联苯环辛烯类木脂素是南、北五味子镇静催眠的活性物质[13]。

BAC1357911t/min0.040.670.661.092.072.593.224.134.635.556.226.837.57tR=6.83min，可能为五味子中与GABA受体蛋白结合成分8.949.319.5310.249.768.256.385.672.592.081.511.090.739.769.608.237.273.563.042.042.080.721.691.50

A．五味子组：1 mL蛋白+1 mL五味子提取液(5 mg/mL) +3 mL PBS液； B.地西泮组：1 mL蛋白+2 mL地西泮(5 mg/mL)+2 mL PBS液； C.五味子+地西泮组：1 mL蛋白+1 mL五味子提取液(5 mg/mL) +2 mL地西泮(5 mg/mL)+1 mL PBS液。

图1　3组检测样品的HPLC图谱

图2五味子组样品中保留时间为6.83 min的物质的质谱图

Figure 2The MS chromatogram ofS.chinensisgroup(tR=6.83 min)

3讨论

受体配体结合试验既借鉴了蛋白质分子印迹技术的原理[14]，又利用了高特异高选择的受体配体结合理论作为试验设计的重要依据。受体理论是分子药理学的核心理论之一，是从分子水平阐明生命的生理病理过程、药物的作用机制、药物分子构效关系的一个重要依据[8-9]。某一个受体被研究清楚后，有可能会成为药物设计的靶标。研究、确认与已知靶点有结合的成分有助于药物有效成分的筛选[15]，尤其是为中药有效分子的确认提供研究基础，突破中药有效物质基础和作用机理研究的瓶颈，加快中药新药有效成分、机制、代谢、转运、排泄机制的研究及新药研发的速度。

五味子是传统的安神药，对其镇静催眠作用的研究大部分是采用自主活动记数法和协同阈下剂量戊巴比妥钠的镇静催眠法，成分鉴定大多采用HPL-MS联用法，其中的木脂素类成分是活性成分[16]。徐丽华等[13]通过镇静催眠动物模型试验，探讨了南、北五味子各化学部位的镇静催眠药效学活性，采用HPLC-MS联用技术分析2种五味子镇静催眠活性部位的组成成分，结果表明，南、北五味子的镇静催眠有效部位均是木脂素。李晓光等[17]验证了五味子的镇静催眠有效活性成分主要为五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子醇甲等。

本文选用具有镇静催眠的中药五味子与具有GABA受体结合的模型药地西泮作为研究对象，先制备大鼠大脑皮质脑组织蛋白匀浆，获得具有GABA受体的蛋白质，为地西泮产生镇静催眠作用提供印迹模板。同时，采用体外试验可降低体内反应对药物的代谢影响，可以更明确参与反应的药物分子的结构与分子质量。由于受体配体结合的专一性、可逆性、可被竞争置换的性质[18]，五味子镇静催眠有效成分与地西泮通过竞争置换性结合靶点，在药靶定量的情况下，与受体蛋白结合的五味子成分随地西泮加入而被竞争性置换，这也提示了五味子产生镇静催眠的作用机制可能与地西泮类似，即五味子镇静催眠有效成分与中枢BDZ受体结合而促进γ-氨基丁酸(GABA)的释放或促进突触传递功能，从而达到镇静催眠的药理作用。本文HPLC-MS表征结果表明，五味子提取物与包含GABA蛋白质结合表征的色谱图中，保留时间为6.83 min的物质可能为五味子产生镇静催眠作用的有效成分，其m/z为415，结合文献[13]的报道，推测该物质为中药五味子中的木脂素类成分五味子甲素(deoxyschizandrin，分子式为C24H32O6，相对分子质量为416.51)。

本文通过地西泮与五味子提取物受体配体竞争性结合-HPLC-MS联用试验，结果显示本研究初步建立的基于受体配体-HPLC-MS联用技术筛选五味子镇静催眠成分的方法是可行的，同时此方法可适用于大部分作用于药靶为受体的中药有效成分研究。该筛选方法具有如下优点：活性有效成分筛选效率高，同时又明确了靶标，节约时间与试验费用成本；受体配体结合试验与质谱或核磁共振分析联合运用，不仅可直接筛选出作用于特定受体的候选化合物，而且能快速获得这些候选化合物的结构信息。因此，本文初步建立了以蛋白质分子印迹技术的原理和受体配体结合理论为基础，以已知阳性对照药物竞争性置换未知中药特定受体结合成分的有效活性成分筛选的技术平台。

参考文献:

[1] 潘超美，黄河清，林晓春.中药研发:现代与传统的碰撞[J].家庭药师，2011，3(1):12-21.

[2] 高月，马增春，张伯礼.中药大品种二次开发的安全性关注及再评价意义[J].中国中药杂志，2012，37(1):1-4.

[3] 姚新生.中药活性成分研究与中药现代化[J].中药新药与临床药理，2003，14(2):73-75.

[4] LI T,PENG T. Traditional Chinese Herbal Medicine as a source of molecules with antiviral activity[J].Antiviral Res，2013，97(1):1-9.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社，2010:61.

[6] 张健茁，孙广仁，王春梅，等.北五味子不同方法提取物的功能活性研究[J].北华大学学报(自然科学版)，2015，16(3): 320-324.

[7] 黄文倩，李丽，肖永庆，等.HPLC同时测定五味子中6种木脂素类成分[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(10):63-66.

[8] 李俊旭.受体理论的历史与现状[J].今日药学，2010，20(8):1-4.

[9] WANG Z Y， KANG H，JI L L，et al. Proteomic characterization of the possible molecular targets of pyrrolizidine alkaloid isoline-induced hepatotoxicity[J].Environ Toxicol Pharmacol，2012，34(2):608-617.

[10] 朱依谆，殷明.药理学[M].7版. 北京：人民卫生出版社，2011:35-59.

[11] 党军强，李学文，刘卫平.两种方法提取脑组织总蛋白的色谱串联质谱分析[J].中华神经外科疾病研究杂志，2009，8(5)：413-416.

[12] 臧林泉，王乃平，韦锦斌，等.HP450和CytP450在大鼠急性肝炎中的变化[J].中国药理学通报,1998，14(4):80-82.

[13] 徐丽华，黄芳，孙萌，等.南北五味子镇静催眠活性部位共有成分的分析[J].分析化学，2009，37(6):828-834.

[14] 王颖，李楠.分子印迹技术及其应用[J].化工进展，2010，29(12):2315-2321.

[15] 董倩倩，李萍，宋越，等.靶细胞提取和高效液相飞行时间质谱联用分析预测丹参中的有效成分[R].南京：中国药科大学现代中药教育部重点实验室、生药学教研室，2007.

[16] 石绘，万丽华，李贺，等.北五味子木脂素对小鼠镇静催眠作用的实验研究[J].中国老年保健医学，2012，10(5): 27-28.

[17] 李晓光，高勤，翁文，等.五味子有效部位及其药理作用研究进展[J].中药材，2005，28(2):156-159.

[18] 李秀峰，曾衍钧，赵红，等.受体与配体结合的动力学研究进展[J].力学进展，2000，30(4):605-612.

(责任编辑：陈翔)

A novel method for screening effective constituents ofSchisandrachinensis(Turcz.)Baill. by receptor ligand-HPLC-MS techniques

WANG Youdi1,YANG Yuanyuan2,LI Jiahong1,GAO Siyuan2,YANG Chen1,ZANG Linquan2

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine；2.SchoolofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To establish a new method for screening effective components of Schisandra chinensis (Turcz.)Baill. by receptor ligand binding assays and HPLC-MS analysis techniques,which could lay the foundation for the rapid analysis and confirm method of the effective components in the single or compound traditional Chinese Medicine prescription. This method even provided a new research idea and method for the study of the effective material foundation and the mechanism or drug target of the traditional Chinese Medicine. Methods The protein extracts contained GABA receptors of brain tissue of rats were the prepared under the receptor ligand binding principle,which was used to establish the in vitro model of the combination of the GABA receptor and the drug. Diazepam was used to replace the monomer composition of S. chinensis combined with the GABA receptor competitively. The experiment was based on the method that diazepam played sedative and hypnotic effects by combining with GABA receptor and was competitively combined the same receptor as S. chinensis. The effective monomer of the S. chinensis which had combined with the GABA receptor was identified by means of HPLC-MS analysis techniques. The effect of the monomer on the activity of sedative and hypnotic was confirmed by literature retrieval. Results A rapid screening method for the effective components of the single traditional Chinese herb was established by receptor ligand binding assays and HPLC-MS analysis techniques. The application of this method to study the effective components with sedative and hypnotic activity of S. chinensis, showed that diazepam competitively replaced the aqueous extract of S. chinensis combined GABA receptor,and the HPLC-MS analysis result revealed that deoxyschizandrin (Molecular formula: C24H32O6,molecular weight: 416.51) maybe the monomer of the schisandra chinensis which combined with the GABA receptor. The literature retrieval result showed that deoxyschizandrin was the effective component with sedative and hypnotic effects of S. chinensis. Conclusion A novel method for screening effective components in the single or compound prescription of traditional Chinese Medicine by receptor ligand binding techniques has been initially established. Meanwhile,the method has preliminary confirmed that deoxyschizandrin maybe the monomer of the S.chinensis that combined with the GABA receptor.

Key words:receptor ligand binding; HPLC-MS; Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.; effective component; methodology

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110202

中图分类号：R284.2

文献标志码：A

文章编号:1006-8783(2016)01-0014-05

作者简介：王有娣(1989—)，女，2013级硕士研究生，Email:13450260093@163.com；通信作者：臧林泉(1965—)，男，博士，教授，从事药理学研究，Email:zanglq@yahoo.com。

基金项目：广东省科技计划项目(2015A020211028)；吴阶平医学基金会(320.6750.1208)；广东省医学科研基金(A2013320)

收稿日期：2015-11-02

网络出版时间：2016-01-15 17:00网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1700.006.html