郝蔚++王丽丽++景伟文++李克梅++陈全家++李丹++顾爱星

摘要：建立了一种改进的棉酚和单宁含量高效液相色谱测定方法，确定该测定方法的优点和适用范围，通过室内用棉花黄萎菌孢子悬浮液对不同抗病性的12个棉花品种进行接菌，测定了叶片和根部棉酚和单宁的含量，并与未接菌的对应品种进行比较，研究不同棉花品种棉酚和单宁的含量与对落叶型黄萎病抗病性的关系，并且明确棉株不同组织中棉酚、单宁与品种抗病性的关系。结果表明，对该测定方法分析条件做了改进，试验精密度及重复性好（棉酚RSD=1.06%，单宁RSD=1.64%），准确度高（回收率为棉酚98%～102%，单宁98%～102.3%）。经过棉花黄萎病菌的诱导，棉酚含量比未经诱导高；未接菌根部棉酚平均含量比叶部棉酚平均含量高出8.65%，而接菌处理则高出4.56%；且抗病品种棉酚含量均高于感病品种，棉酚含量与棉花品种相对病情指数呈显著负相关（叶片未接菌r=-0.936，叶片接菌处理r=-0.941，根未接菌r=-0.991，根接菌处理r=-0.939）。未接菌叶部单宁平均含量比根部单宁平均含量高出6.81%，而在接菌处理下高出1.90%。未接菌的抗病品种叶部和根部的单宁含量均高于感病品种叶部和根部的单宁含量，单宁含量与相对病情指数呈显著负相关（叶片未接菌r=-0.992，根未接菌r=-0.988）；而在接菌处理下呈现相反趋势，单宁含量与相对病情指数呈显著正相关（叶片接菌处理r=0.980，根接菌处理r=0.874）。

关键词：棉花；单宁；棉酚；抗病性；黄萎病；高效液相色谱法

中图分类号： S435.621.2+4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0147-04

收稿日期：2015-01-20

基金项目：新疆研究生科研创新项目（编号：xjau-2013-yjsky—）；新疆维吾尔自治区科学技术厅高技术项目（编号：201111117）；棉花生物学国家重点实验室开放课题（编号：CB2014A05）。

作者简介：郝蔚（1989—），女，陕西麟游人，硕士研究生，主要从事棉花抗病育种研究。E-mail：982733172@qq.com。

通信作者：顾爱星，博士，副教授，硕士生导师，主要从事作物转基因、微生物资源利用和抗病虫分子克隆的研究。Tel：（0991）8763825；E-mail：guai_xing@sina.com。棉花黄萎病是一种土传维管束病害，广泛分布于世界各产棉国，对棉花的生产造成了严重影响。自20世纪90年代以来，我国棉花黄萎病持续暴发对棉花的危害和产量影响严重。棉花黄萎病（Verticillium wilt）被称为棉花“癌症”[1]，在生产中极具毁灭性。1935年，棉花黄萎病传入中国，并逐渐在478个产棉县（市）蔓延[2]。新疆是我国主要产棉区，近年来黄萎病发生严重[3]。由于棉花黄萎病菌能够以微菌核的形式长期存活于土壤中，因此防治困难，目前仍无有效的防治方法[4-5]。当黄萎病菌侵染[6]棉株，会引起棉株发生一系列生理生化反应[7-8]。研究表明，黄萎病菌侵染棉花后，毒素作用使得病原菌可以在寄主体内蔓延、扩展，棉花为了抵抗病菌的侵害，自身的生理生化代谢会向着有助于产生抗病物质的方向发展。植物次生代谢是植物在进化过程中对环境适应的结果，植物受到病原菌侵染后，会有小分子的抗性物质，用以增强自身的抵抗力。棉酚和单宁等次级代谢产物对棉花的抗病有一定影响，棉花受病原菌侵染后，体内棉酚和单宁含量明显增加，因而推测棉酚和单宁对棉花抗病性有一定的作用。

棉花黄萎病一直是我国棉花抗病遗传育种领域植物病理学研究的重点。从棉花生产需求出发，分离并鉴定与棉花抗黄萎病有关的次级代谢产物，探明抗性生理生化机制[9]，不但有利于病理学和棉花遗传育种学的发展完善，而且对创制抗病高产种质、棉花抗病育种工作和提高病害综合防治成效都具有重要的理论和实践意义。

目前对于落叶型黄萎病棉花的次级代谢产物含量与抗病性关系的报道较少，对于次级代谢产物变化规律与抗病程度的关系研究有待深入研究，探明棉花对黄萎病抗性机制，对该病的抗病育种和防治工作具有重要意义。本研究用落叶型黄萎病菌侵染不同抗病性的棉花品种，采用人工接种落叶型黄萎病菌后，在苗期测定叶片和根部棉酚及单宁含量，通过研究棉花黄萎病棉株的棉酚和单宁含量与抗黄萎病性的关系，为棉花黄萎病的抗病性鉴定提供依据。笔者所在课题组根据文献[10]，结合实验室条件对已发表文献报道方法做了一些改进，建立测定棉酚和单宁的方法，使用高效液相色谱法（HPLC）对棉花叶片和根部的次级代谢产物棉酚和单宁进行分离和测定，分析了落叶型黄萎病菌侵染前后棉株体内棉酚和单宁含量的变化，以探讨棉酚和单宁与落叶型黄萎病菌棉花抗病性的关系，以期为黄萎病的综合防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1供试材料

供试棉花为盆栽棉花（冀668、辽棉18号、新海13号、军海1号、新海30号、新海1号、川243、大铃棉、硕丰1号、108夫、军棉1号、K222）。供试棉花黄萎病菌株为落叶型棉花黄萎病菌V76（由美国南部平原棉花研究所提供）。

1.2仪器与试剂

岛津LC-20AB型高效液相色谱仪，SPD-M20A检测器，色谱柱：C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），超声清洗器，振荡器，离心机，粉碎机。

棉酚标准样品购自Sigma公司（95%，规格20 mg），单宁标准样品购自Sigma公司（95%，规格20 mg），丙酮（天津市光复科技发展有限公司），甲醇（天津市光复科技发展有限公司），无水乙醇（天津市光复科技发展有限公司），以上均为分析纯；甲醇（色谱纯）；磷酸（优级纯）。

1.3方法

1.3.1样品的处理称取棉株的不同组织，粉碎并过40目筛，取样品0.1 g左右（精确至0.000 1 g）置于100 mL容量瓶中，以70%丙酮稀释定容到50 mL，振荡溶解后静置1 h，放超声清洗器中30 min，静置片刻，取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，测定棉酚时进样10 μL。

取棉株的不同组织，粉碎并过40目筛，取样品0.1 g左右（精确至0.000 1 g）加入提取剂（丙酮水1 ∶1溶液60 mL），置于超声清洗器中30 min，取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，测定单宁时进样10 μL。

1.3.2色谱条件棉酚色谱柱C18柱（5 μm，4.6×150 mm），柱温25 ℃，流动相为甲醇-体积分数1%磷酸溶液（90 ∶10，V/V），流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，进样量10 μL。

单宁色谱柱C18柱（5 μm，4.6×150 mm），柱温22 ℃，流动相为甲醇和水（体积比80 ∶20），流速为 0.5 mL/min，检测波长 265 nm，进样量10 μL。

1.3.3取叶方法接菌15 d后，棉花表现出明显症状后开始取样，09：00开始取第1张真叶，去除叶脉后剪碎混匀，称取0.5 g，续取3 d。每次测定采用随机取样方式，所有指标数据均为3次重复。

1.3.4数据处理采用 SPSS 18.0统计软件对数据进行统计分析。计量资料均以“均数±标准偏差（x±s）”表示，进行方差分析。各因素之间采用线性回归方程进行相关分析。指标间相关性采用相关系数r值表示；P<0.05表示有显著性统计学意义。

1.3.5棉种处理挑选饱满的棉籽，首先用75%乙醇清洗2次，每次35 s，其次用30%H2O2浸泡 4～5 h后，用无菌水摇动清洗2～3遍，放入智能培养箱，在无菌水中浸泡催芽12 h，选露白的棉籽播种于装有灭菌花卉用土的塑料花盆中，每个品种播种4个花盆，灭菌土覆盖2～3 cm铺平压紧，花盆口覆盖1层地膜保湿，每个花盆种植5粒种子，播种后将花盆置于托盘内[11-12]，播种后进行常规的温室管理，昼温30 ℃，夜温 25 ℃，相对湿度 50%，光照各12 h，第3张真叶展平时进行人工接菌。

1.3.5病原菌的培养及接种方法菌液的配制在新疆农业大学生物楼制作完成，将落叶型黄萎菌V76接入PDA液体培养基，放入振荡培养箱使之繁殖生长72 h后，3层灭菌纱布过滤，用显微镜直接计数法计算菌液中孢子含量为2×106～3×106个/mL，4 ℃冷藏备用。

切根蘸菌法：等棉株长到2～3张真叶时接菌，剪刀灭菌后剪掉塑料花盆底部[13-14]，并将露出的棉苗须根剪掉 1～3 mm，放入盛有40 mL孢子悬液的培养皿中，菌液浓度为 2×106～3×106个/mL，放回托盘中，不接菌的以无菌水浸泡作为对照，接菌40 min后在托盘中灌满清水，保持高湿状态 48 h，温度25 ℃。以后常规浇水。

1.3.6病级分类0级：健株，叶片无病状；1级：有25%及以下的叶片表现症状，即叶片出现叶肉变黄或呈现不规则形的黄色病斑；2级：26%～50%的叶片表现病状，病斑颜色大部分变为黄色或黄褐色，叶片边缘略有卷枯现象；3级：51%～75% 的叶片表现病状，少数病叶凋落；4级：76%及以上的叶片表现病状，多为褐色掌状枯斑，严重时叶片大量脱落，甚至棉株枯死。病情指数按下列公式计算：病情指数=（∑各级病叶数×相应病级）/（总叶数×最高病级）×100；相对病情指数=校正系数K×鉴定材料病情指数；校正系数K= 50/感病对照品种实际病指，50为规定感病对照的标准病指。抗病性分级标准详见表1。

2结果与分析

2.1方法学评价

2.1.1重复性测定选择同一个品种称取6份样品各0.1 g于具塞离心管中，加入提取单宁和棉酚溶剂，超声-振荡提取后离心，取上清液过滤后进行测定，考察试验的精密度，结果棉酚RSD为1.06%（表2），单宁RSD为1.64%（表3），表明试验的重复性及仪器的精密度良好。

2.1.2回收率试验称取同一个品种样品3份，每份0.1 g，按上述确定的条件进行提取和测定，通过峰面积计算出样液中棉酚和单宁的浓度，在提取液中分别加入棉酚和单宁标准液（实际量为1、2、3 mg/L）进行测定，通过峰面积计算出加标后浓度，计算回收率，所得回收率棉酚为98%～102%，单宁为98%～102.3%（表4、表5）。

2.2不同棉花品种的相对病情指数和抗性级别

可由表6可知，抗病材料3份，占25%；耐病材料5份，占41.67%；感病材料4份占33.33%。

2.312个棉花品种的棉酚含量

由表7可见，最高抗病性品种是冀668，最低抗病性品种

是K222。在叶片和根部、未接菌和接菌处理间棉酚的含量均存在显著差异（P<0.05），在未接菌情况下根部棉酚平均含量比叶部棉酚平均含量高出8.65%，而在接菌处理下高出 4.56%。抗病品种无论叶部和根部接菌前酚类物质含量均高于感病品种，而且根部的含量高于叶部的含量，接菌后所有品种叶部的酚类物质含量都比接菌前有所增加，抗病性高的品种酚类物质含量显著高于抗病性低的品种，由此表明棉酚含量与品种抗病性有关。

2.412个棉花品种的单宁含量

由表8可见，叶片和根部、未接菌和接菌处理间单宁的含量均存在显著差异（P<0.05）；在未接菌情况下叶部单宁平均含量比根部单宁平均含量高出6.81%，而在接菌处理下高出1.90%。接菌后所有品种的单宁含量比接菌前都有所增加。无菌处理的抗病品种单宁含量均高于感病品种，而在接菌处理下趋势相反。

2.512个棉花品种相对病情指数与其不同组织棉酚和单宁含量的关系

无论是在根部还是叶片，在接菌处理和未接菌处理中，棉酚含量与品种的相对病情指数呈负相关。抗病性越差，相对病情指数越高，棉酚的含量越小。在未接菌的叶部和根部，单宁含量与品种的相对病情指数呈负相关，相对病情指数越高，单宁含量越小；而在接菌处理的叶部和根部，单宁含量与品种的相对病情指数呈正相关。

3讨论

通过查找文献发现，测定棉酚和单宁的方法有紫外分光光度法和液相色谱法，液相色谱法优于紫外分光光度法，故笔者对液相色谱法进行了改进，并用重复性和回收试验进行了方法学评价，棉酚的RSD为1.06%，单宁的RSD为1.64%；棉酚回收率为98%～102%，单宁的为98.0%～102.3%。采用高效液相色谱法测定含量，样品处理方法省时简便、取样少、分离效果比较好、结果可靠。本方法对流动相进行了改进，前人用多种试剂作为复合流动相，而本研究都是应用单一试剂，方便快速，精密度高，结果准确可靠。

抗病性是由相对病情指数来表达的，相对病情指数越低抗病性越高，相对病情指数越高抗病性越低。无论是在根部还是叶片，在未经黄萎病菌诱导和接菌处理中，棉酚含量与品种的相对病情指数都呈负相关。单宁在未经黄萎病菌诱导时含量与品种的相对病情指数呈负相关，而接菌后单宁含量呈正相关。感病品种单宁含量对落叶型黄萎病菌反应明显，感病品种接菌后，单宁含量激增；无菌处理的抗病品种单宁含量均高于感病品种，而在接菌处理下趋势相反，可能是感病品种启动防卫反应产生大量的单宁。棉酚含量在接菌前后的变化趋势相近，因此苗期不接菌即可测定棉酚含量判定品种（系）抗性的指标，这样可以简化测定步骤，节约测定时间。

本试验测得接菌前后根部棉酚含量高于叶部，可能是因为根部先接触病菌，反应比叶部明显，说明使用根部作为测定次级代谢产物的试验材料更具有代表性。沈其益认为棉根中棉酚的含量高与抗病菌侵入及根内扩展密切相关[6]。而单宁接菌前后叶部含量高于根部，可能是因为单宁与棉酚诱发部位不同。吕金殿等研究发现在同一品种中，无论是棉酚还是单宁含量，接菌处理均比未接菌的含量高[15]。本研究得出接菌后的棉酚和单宁含量均有所升高，由此说明病原菌可以刺激植物本身产生小分子的抗性物质，用来增强自身的抵抗力。

棉酚和单宁是棉花植株内重要的次生性物质，对棉花病害表现出较好的抗性。本研究用强致病落叶型黄萎病菌侵染棉花，并在苗期测定棉花单宁的含量，探讨棉花初期强致病力病菌侵染下次级代谢产物的含量与抗病性的关系。

4结论

抗病品种的棉酚含量均高于感病品种相应组织中的含量，根组织内的含量又高于叶片。接种棉花黄萎病菌叶片或根部棉酚含量比不接菌略有上升，抗病品种增长幅度显著高于感病品种。棉酚含量与棉花品种相对病情指数呈显著负相关。

未接菌抗病品种单宁含量显著高于感病品种，接菌之后呈相反趋势。叶片组织内的含量显著高于根组织。经黄萎病菌侵染后，棉苗组织中单宁含量比未接菌均有显著提高。

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