杜仲黄酮对H22小鼠的抑瘤作用及其机制

2016-04-09袁带秀舒丽霞吉首大学医学院湖南吉首46000

中国老年学杂志 2016年2期

关键词：抗肿瘤杜仲黄酮

袁带秀舒丽霞　黄　蓉　(吉首大学医学院，湖南　吉首　46000)

杜仲黄酮对H22小鼠的抑瘤作用及其机制

袁带秀1舒丽霞黄蓉(吉首大学医学院，湖南吉首416000)

1吉首大学植物资源与利用湖南省高校重点实验室

第一作者:袁带秀( 1975－)，女，硕士，高级实验师，主要从事民族药用植物生理生化研究。

〔摘要〕目的研究杜仲黄酮体内抗肿瘤作用，探讨其可能作用机制。方法将小鼠肝癌H22细胞经体外培养并于昆明小鼠腹腔内传代后，无菌接种于小鼠皮下，建立荷瘤小鼠模型。采取不同剂量杜仲黄酮( 200、100、50 mg/kg) ig给药，每天1次，连续12 d; CTX组隔日ip给药，给药6次，计算抑瘤率、脾脏指数;分离血清，ELSA法检测血清肿瘤坏死因子( TNF)－α和白细胞介素( IL)－2，比色法检测血清总抗氧化活力( T－AOC)和丙二醛( MDA)水平。结果与模型组比较，杜仲黄酮能显著降低移植瘤瘤质量( P＜0．05)，明显升高荷瘤小鼠的脾脏指数( P＜0．05)，升高血清IL－2、TAOC水平，降低TNF－α、MDA水平。结论杜仲黄酮对H22移植瘤有一定的抑制作用，其机制可能与其调节IL－2和TNF－α等细胞因子的分泌，增强荷瘤小鼠免疫功能，提高机体抗氧化能力有关。

〔关键词〕杜仲;黄酮; H22;抗肿瘤;抗氧化

杜仲具补肝肾、强筋骨、降血压、安胎等诸多功效。现代药理学研究认为，杜仲中含有黄酮等多种生物活性物质，具有抗癌、抗衰老、降血压、抗菌消炎、增强机体免疫等多种药理作用〔1〕。本研究探讨杜仲黄酮体内抑瘤作用及可能机制。

1材料与方法

1. 1材料雄性昆明小鼠，体质量18～22 g，清洁级，合格证号: SCXK(湘) 2011－0003，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供;小鼠H22肝癌细胞株由华中科技大学同济医学院药理系惠赠。注射用环磷酰胺( CTX)购自江苏恒瑞医药股份有限公司;小鼠白细胞介素( IL)－2、肿瘤坏死因子( TNF)－αELSA试剂盒购自上海劲马实验设备有限公司;蛋白质试剂盒、丙二醛试剂盒( MDA)和总体抗氧化活力( T－AOC)试剂盒均购自南京建成生物技术研究所。杜仲叶采自吉首大学资源与环境学院教学楼旁边，由该院陈功锡教授鉴定。

1. 2方法

1. 2. 1杜仲黄酮的制备将杜仲叶烘干，粉碎机将其粉碎后用65%乙醇超声提取，提取液过滤;所得滤液置旋转蒸发器进行浓缩，再在浓缩液中加入石油醚进行除脂分液，把分液后的滤液下层倒入大孔树脂，静态吸附2 h以上，再用去离子水洗脱，90%左右乙醇解析2 h以上;解析液再进行浓缩;用异丙醇洗2次，过滤，将滤液浓缩;加入甲醇除杂，最后得棕黄色的杜仲总黄酮。以芦丁做对照，紫外分光光度计测得杜仲总黄酮的纯度为83．61%。

1. 2. 2 H22肝癌移植瘤小鼠模型的建立常规方法复苏H22小鼠肝癌细胞，取0．2 ml细胞悬液注射到雄性昆明小鼠腹腔内，连续传两代。无菌操作取第2代腹水，用无菌生理盐水稀释，调整细胞密度为1×106个/ml，于昆明小鼠右股部行皮下无菌接种，接种量为每只0．2 ml。

1. 2. 3实验动物分组及处理接种24 h后称重分组，将小鼠随机分为杜仲黄酮高、中、低剂量( 200、100、50 mg/kg)组和CTX组;每组10只。杜仲黄酮各给药组ig给药，每日1次，共12次; CTX组按20 mg/kg剂量隔日ip给药1次，共6次;模型组则以生理盐水替代药物ig给以小鼠药。各组动物给药第12天停药，禁食不禁水16 h后处死。另取10只正常小鼠设为对照组，每天ig生理盐水，共12 d。

1. 2. 4小鼠H22肝癌皮下移植瘤的抑瘤率、免疫器官指数以及血清相关指标的测定分别称取小鼠体质量、瘤质量，计算抑瘤率。并称取脾脏质量，计算脾脏指数。眼眶取血，分离血清，酶联免疫吸附试验( ELISA)法检测血清TNF－α和IL－2，比色法检测血清T－AOC和MDA水平。抑瘤率= (模型组瘤质量－药物组瘤质量) /模型组瘤质量;脾脏指数=脾脏质量/体质量。

1. 3统计学分析利用SPSS16．0统计软件行单因素方差分析及q检验。

2结果

2. 1对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响杜仲黄酮对昆明小鼠H22实体瘤的生长具有一定的抑制作用，其抗肿瘤效应呈剂量依赖性，高剂量组的抑瘤率低于CTX组;与模型组比较，CTX组和杜仲黄酮高、中剂量组荷瘤小鼠瘤质量显著减轻( P＜0．05)，而杜仲黄酮高、中、低各剂量间无显著差异( P＞0．05)。见表1。

表1杜仲黄酮对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用(±s，n=10)

与模型组比较: 1) P＜0．05

组别　　瘤质量( g)　　抑瘤率( %)模型组　1．03±0．19　　－CTX组　0．41±0．051)　60．20杜仲黄酮低剂量组　0．66±0．12　35．90杜仲黄酮低中量组　0．57±0．121)　44．70杜仲黄酮高剂量组　0．54±0．121)　47．60

2. 2对荷瘤小鼠体质量及脾脏指数的影响实验末期杜仲黄酮高剂量组小鼠体质量、脾脏指数与模型组比较差异显著( P＜0．05)。杜仲黄酮高剂量组小鼠体质量、脾脏指数与CTX组比较差异显著( P＜0．05)。杜仲黄酮中剂量组脾脏指数与CTX组比较差异显著( P＜0．05)。但杜仲黄酮各剂量组小鼠体质量、脾脏指数之间比较差异不显著( P＞0．05)。CTX组小鼠脾脏指数低于模型组，也低于杜仲黄酮各组，但差异不显著( P＞0．05)。见表2。

2. 3对荷瘤小鼠血清TNF－α和IL－2水平的影响与对照组比较，模型组、CTX组及杜仲黄酮各剂量组小鼠TNF－α水平显著升高( P＜0．05)，IL－2水平显著降低( P＜0．05)。与模型组比较，CTX组和杜仲黄酮高剂量组小鼠TNF－α水平显著降低( P＜0．05)，而杜仲黄酮高、中剂量组小鼠IL－2水平显著升高( P＜0．05)。见表3。

2. 4对荷瘤小鼠血清抗氧化指标的影响与对照组比较，模型组小鼠血清MDA水平显著升高( P＜0．05)，但T－AOC水平变化差异不显著。与模型组比较，CTX组小鼠血清MDA水平显著降低( P＜0．05)，杜仲黄酮高、低剂量组小鼠血清T－AOC水平显著升高( P＜0．05) ;杜仲黄酮高、低剂量组小鼠血清T－AOC也明显高于CTX组( P＜0．05) ;杜仲黄酮高剂量组T－AOC与其低、中剂量组比较差异显著( P＜0．05)。见表3。

表2杜仲黄酮对H22荷瘤小鼠的体质量及脾脏指数的影响(±s，n=10)

与模型组比较: 1) P＜0．05;与CTX组比较: 2) P＜0．05

组别　　体质量( g)实验前　　实验后脾脏指数( mg/g)模型组　19．90±0．16　 30．77±2．68　 3．78±0．49 CTX组　20．13±0．05　 30．53±1．96　 3．10±0．31杜仲黄酮低剂量组　20．00±0．17　 31．34±1．94　 4．23±0．31杜仲黄酮中剂量组　19．94±0．07　 32．44±2．15　 4．90±0．522)杜仲黄酮高剂量组　20．11±0．20　 33．28±2．001) 2)5．22±0．611) 2)

表3杜仲黄酮对H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2水平和抗氧化指标的影响(±s，n=10)

与对照组比较: 1) P＜0．05;与模型组比较: 2) P＜0．05;与CTX组比较: 3) P＜0．05;与杜仲黄酮低、中剂量组比较: 4) P＜0．05

组别　TNF－α( ng/ml)　IL－2( ng/ml)　T－AOC( U/ml)　MDA( nmol/ml)对照组　0．50±0．01　1．36±0．01　8．81±0．77　7．38±0．45模型组　0．79±0．041)　0．98±0．021)　8．19±0．58　12．58±0．801)CTX组　0．61±0．021) 2)　1．08±0．071)　7．69±0．79　9．95±0．251) 2)杜仲黄酮低剂量组　0．73±0．031) 3)　1．02±0．041)　11．76±1．091) 2) 3)　11．24±0．521)杜仲黄酮中剂量组　0．78±0．041) 3)　1．21±0．041) 2)　9．20±0．92　12．09±0．631) 3)杜仲黄酮高剂量组　0．67±0．031) 2) 4)　1．17±0．061) 2) 4)　13．29±1．111) 2) 3) 4)　11．54±0．711)

3讨论

黄酮类化合物具有抑菌消炎、抗氧化、抗衰老、抗癌防癌等诸多生理活性〔2〕。本实验结果显示，50、100、200 mg/kg剂量的杜仲黄酮ig给药12 d，均能抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，虽然其抑瘤作用不如CTX( 60%)强，但能减少因化疗所致荷瘤小鼠体质量减轻和免疫力下降等不良反应，能够提高荷瘤小鼠的脾脏指数，增加体质量。

IL－2是由抗原活化的T细胞分泌的一种重要的淋巴因子，在机体的免疫应答和调节中起重要作用〔3〕。IL－2的含量与细胞的免疫功能密切相关，因此，IL－2降低是肿瘤患者细胞免疫功能受损的一项重要标志。本研究发现，肝癌H22移植瘤小鼠血清IL－2水平较正常小鼠显著降低，而杜仲黄酮给药后荷瘤小鼠血清IL－2水平明显升高。说明杜仲黄酮可改善荷瘤小鼠免疫指标，提高机体抗肿瘤能力。

TNF－α是参与机体免疫和炎症反应的细胞因子〔4，5〕，在机体抗肿瘤过程中发挥重要作用。一方面，TNF－α可通过抑制肿瘤血管生成等间接途径影响肿瘤细胞生长，另一方面，还可诱导多种肿瘤细胞凋亡〔6〕。本研究结果表明，肝癌H22移植瘤小鼠血清TNF－α水平较正常小鼠升高，而杜仲黄酮给药后荷瘤小鼠血清TNF－α水平却降低，趋向于正常水平，说明杜仲黄酮抗肿瘤作用时，可通过诱导细胞凋亡等方式导致肿瘤细胞数目的减少，引起肿瘤细胞分泌到循环系统中TNF－α等细胞因子水平相应降低。因此，TNF－α变化可能反映了杜仲黄酮抗肿瘤作用的药用效果，至于TNF－α变化本身是否参与了其抗肿瘤的病理生理过程，还需进一步的研究探讨。

研究已证明自由基与人类肿瘤的发生，发展及防治密切相关。MDA是脂褐质形成过程中的中间产物，其含量可间接反映机体内自由基的产生情况和细胞的脂质过氧化程度;而T－AOC反映的是机体总的抗氧化能力，它的下降表明机体整体的抗氧化能力降低了。本研究结果显示，杜仲黄酮能降低H22荷瘤小鼠血清MDA水平，提高T－AOC活力，表明杜仲黄酮抗肿瘤作用还可能与其抗氧化作用有关。

综上，杜仲黄酮对H22移植瘤有一定的抑制作用，其机制可能与其增强荷瘤小鼠免疫功能，调节IL－2和TNF－α等细胞因子的分泌，提高机体抗氧化能力有关。